（完整版）紫外-可見分光光度法教案

（完整版）紫外—可見分光光度法教案第五章紫外—可見分光光度法一．教學(xué)內(nèi)容1．紫外－可見吸收光譜的產(chǎn)生（分子的能級及光譜、有機(jī)物及無機(jī)物電子能級躍遷的類型和特點(diǎn)）2．吸收定律及其發(fā)射偏差的原因3．儀器類型、各部件的結(jié)構(gòu)、性能以及儀器的校正4．分析條件的選擇5．應(yīng)用（定性及結(jié)構(gòu)分析、定量分析的各種方法、物理化學(xué)常數(shù)的測定及其它方面的應(yīng)用二．重點(diǎn)與難點(diǎn)1．比較有機(jī)化合物和無機(jī)化合物各種電子躍遷類型所產(chǎn)生吸收帶的特點(diǎn)及應(yīng)用價值2．進(jìn)行化合物的定性分析、結(jié)構(gòu)判斷3．定量分析的新技術(shù)（雙波長法、導(dǎo)數(shù)光譜法、動力學(xué)分析法）4．物理化學(xué)常數(shù)的測定三．教學(xué)要求1．較為系統(tǒng)、深入地掌握各種電子躍遷所產(chǎn)生的吸收帶及其特征、應(yīng)用2．熟練掌握吸收定律的應(yīng)用及測量條件的選擇3．較為熟練儀器的類型、各組件的工作原理4．運(yùn)用各種類型光譜及的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則，判斷不同的化合物5．掌握定量分析及測定物理化學(xué)常數(shù)的常見基本方法6．一般掌握某些新的分析技術(shù)四．學(xué)時安排5學(xué)時研究物質(zhì)在紫外、可見光區(qū)的分子吸收光譜的分析方法稱為紫外-可見分光光度法。紫外—可見分光光度法是利用某些物質(zhì)的分子吸收200~800nm光譜區(qū)的輻射來進(jìn)行分析測定的方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定性和定量測定。第一節(jié)紫外—可見吸收光譜一、分子吸收光譜的產(chǎn)生在分子中，除了電子相對于原子核的運(yùn)動外，還有核間相對位移引起的振動和轉(zhuǎn)動。這三種運(yùn)動能量都是量子化的，并對應(yīng)有一定能級。在每一電子能級上有許多間距較小的振動能級，在每一振動能級上又有許多更小的轉(zhuǎn)動能級。若用△E電子、△E振動、△E轉(zhuǎn)動分別表示電子能級、振動能級轉(zhuǎn)動能級差，即有△E電子>△E振動>△E轉(zhuǎn)動。處在同一電子能級的分子，可能因其振動能量不同，而處在不同的振動能級上。當(dāng)分子處在同一電子能級和同一振動能級時，它的能量還會因轉(zhuǎn)動能量不同，而處在不同的轉(zhuǎn)動能級上。所以分子的總能量可以認(rèn)為是這三種能量的總和：E分子=E電子+E振動+E轉(zhuǎn)動當(dāng)用頻率為ν的電磁波照射分子，而該分子的較高能級與較低能級之差△E恰好等于該電磁波的能量hν時，即有△E=hν（h為普朗克常數(shù)）此時，在微觀上出現(xiàn)分子由較低的能級躍遷到較高的能級；在宏觀上則透射光的強(qiáng)度變小。若用一連續(xù)輻射的電磁波照射分子，將照射前后光強(qiáng)度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，并記錄下來，然后以波長為橫坐標(biāo)，以電信號（吸光度A）為縱坐標(biāo)，就可以得到一張光強(qiáng)度變化對波長的關(guān)系曲線圖——分子吸收光譜圖。二、分子吸收光譜類型根據(jù)吸收電磁波的范圍不同，可將分子吸收光譜分為遠(yuǎn)紅外光譜、紅外光譜及紫外、可見光譜三類。分子的轉(zhuǎn)動能級差一般在0.005~0.05eV。產(chǎn)生此能級的躍遷，需吸收波長約為250~25μm的遠(yuǎn)紅外光，因此，形成的光譜稱為轉(zhuǎn)動光譜或遠(yuǎn)紅外光譜。分子的振動能級差一般在0.05~1eV，需吸收波長約為25~1.25μm的紅外光才能產(chǎn)生躍遷。在分子振動時同時有分子的轉(zhuǎn)動運(yùn)動。這樣，分子振動產(chǎn)生的吸收光譜中，包括轉(zhuǎn)動光譜，故常稱為振-轉(zhuǎn)光譜。由于它吸收的能量處于紅外光區(qū)，故又稱紅外光譜。電子的躍遷能差約為1~20eV，比分子振動能級差要大幾十倍，所吸收光的波長約為12.5~0.06μm，主要在真空紫外到可見光區(qū)，對應(yīng)形成的光譜，稱為電子光譜或紫外、可見吸收光譜。通常，分子是處在基態(tài)振動能級上。當(dāng)用紫外、可見光照射分子時，電子可以從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)的任一振動（或不同的轉(zhuǎn)動）能級上。因此，電子能級躍遷產(chǎn)生的吸收光譜，包括了大量譜線，并由于這些譜線的重疊而成為連續(xù)的吸收帶，這就是為什么分子的紫外、可見光譜不是線狀光譜，而是帶狀光譜的原因。又因?yàn)榻^大多數(shù)的分子光譜分析，都是用液體樣品，加之儀器的分辨率有限，因而使記錄所得電子光譜的譜帶變寬。由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外區(qū)（60~200nm）均有吸收，因此在測定這一范圍的光譜時，必須將光學(xué)系統(tǒng)抽成真空，然后充以一些惰性氣體，如氦、氖、氬等。鑒于真空紫外吸收光譜的研究需要昂貴的真空紫外分光光度計，故在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。我們通常所說的紫外—可見分光光度法，實(shí)際上是指近紫外、可見分光光度法。第二節(jié)化合物紫外—可見光譜的產(chǎn)生在紫外和可見光譜區(qū)范圍內(nèi)，有機(jī)化合物的吸收帶主要由σ→σ*、π→π*、n→σ*、n→π*及電荷遷移躍遷產(chǎn)生。無機(jī)化合物的吸收帶主要由電荷遷移和配位場躍遷（即d—d躍遷和f—f躍遷）產(chǎn)生.由于電子躍遷的類型不同，實(shí)現(xiàn)躍遷需要的能量不同，因此吸收光的波長范圍也不相同。其中σ→σ*躍遷所需能量最大，n→π*及配位場躍遷所需能量最小，因此，它們的吸收帶分別落在遠(yuǎn)紫外和可見光區(qū)。從圖中可知，π→π*（電荷遷移）躍遷產(chǎn)生的譜帶強(qiáng)度最大，σ→σ*、n→π*、n→σ*躍遷產(chǎn)生的譜帶強(qiáng)度次之，（配位躍遷的譜帶強(qiáng)度最?。?。一、有機(jī)化合物的紫外—可見吸收光譜（一）、躍遷類型基態(tài)有機(jī)化合物的價電子包括成鍵σ電子、成鍵π電子和非鍵電子（以n表示）。分子的空軌道包括反鍵σ*軌道和反鍵π*軌道，因此，可能的躍遷為σ→σ*、π→π*、n→σ*n→π*等。1，σ→σ*躍遷它需要的能量較高，一般發(fā)生在真空紫外光區(qū)。飽和烴中的—c—c—鍵屬于這類躍遷，例如乙烷的最大吸收波長λmax為135nm。2，n→σ*躍遷實(shí)現(xiàn)這類躍遷所需要的能量較高，其吸收光譜落于遠(yuǎn)紫外光區(qū)和近紫外光區(qū)，如CH3OH和CH3NH2的n→σ*躍遷光譜分別為183nm和213nm。3，π→π*躍遷它需要的能量低于σ→σ*躍遷，吸收峰一般處于近紫外光區(qū)，在200nm左右，其特征是摩爾吸光系數(shù)大，一般εmax≥104，為強(qiáng)吸收帶。如乙烯（蒸氣）的最大吸收波長λmax為162nm。4，n→π*躍遷這類躍遷發(fā)生在近紫外光區(qū)。它是簡單的生色團(tuán)如羰基、硝基等中的孤對電子向反鍵軌道躍遷。其特點(diǎn)是譜帶強(qiáng)度弱，摩爾吸光系數(shù)小，通常小于100，屬于禁阻躍遷。5，電荷遷移躍遷所謂電荷遷移躍遷是指用電磁輻射照射化合物時，電子從給予體向與接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷。因此，電荷遷移躍遷實(shí)質(zhì)是一個內(nèi)氧化—還原的過程，而相應(yīng)的吸收光譜稱為電荷遷移吸收光譜。例如某些取代芳烴可產(chǎn)生這種分子內(nèi)電荷遷移躍遷吸收帶。電荷遷移吸收帶的譜帶較寬，吸收強(qiáng)度較大，最大波長處的摩爾吸光系數(shù)εmax可大于104。（二）、常用術(shù)語1，生色團(tuán)從廣義來說，所謂生色團(tuán)，是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團(tuán)。但是，人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團(tuán)或結(jié)構(gòu)系統(tǒng)定義為生色團(tuán)。2，助色團(tuán)助色團(tuán)是指帶有非鍵電子對的基團(tuán)，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時，會使生色團(tuán)的吸收峰向長波方向移動，并且增加其吸光度。3，紅移與藍(lán)移（紫移）某些有機(jī)化合物經(jīng)取代反應(yīng)引入含有未共享電子對的基團(tuán)（-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-SR、-NR2）之后，吸收峰的波長將向長波方向移動，這種效應(yīng)稱為紅移效應(yīng)。這種會使某化合物的最大吸收波長向長波方向移動的基團(tuán)稱為向紅基團(tuán)。在某些生色團(tuán)如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波長會向短波方向移動，這種效應(yīng)稱為藍(lán)移（紫移）效應(yīng)。這些會使某化合物的最大吸收波長向短波方向移動的基團(tuán)（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）稱為向藍(lán)（紫）基團(tuán)。(三)有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜1，飽和烴及其取代衍生物飽和烴類分子中只含有σ鍵，因此只能產(chǎn)生σ→σ*躍遷，即σ電子從成鍵軌道（σ）躍遷到反鍵軌道（σ*）。飽和烴的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可見分光光度計的測量范圍。飽和烴的取代衍生物如鹵代烴，其鹵素原子上存在n電子，可產(chǎn)生n→σ*的躍遷。n→σ*的能量低于σ→σ*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n→σ*躍遷分別出現(xiàn)在173、204和258nm處。這些數(shù)據(jù)不僅說明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應(yīng)的吸收波長發(fā)生了紅移，顯示了助色團(tuán)的助色作用。直接用烷烴和鹵代烴的紫外吸收光譜分析這些化合物的實(shí)用價值不大。但是它們是測定紫外和（或）可見吸收光譜的良好溶劑。2，不飽和烴及共軛烯烴在不飽和烴類分子中，除含有σ鍵外，還含有π鍵，它們可以產(chǎn)生σ→σ*和π→π*兩種躍遷。π→π*躍遷的能量小于σ→σ*躍遷。例如，在乙烯分子中，π→π*躍遷最大吸收波長為180nm在不飽和烴類分子中，當(dāng)有兩個以上的雙鍵共軛時，隨著共軛系統(tǒng)的延長，π→π*躍遷的吸收帶將明顯向長波方向移動，吸收強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。在共軛體系中，π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶又稱為K帶。3，羰基化合物羰基化合物含有>C=O基團(tuán)。>C=O基團(tuán)主要可產(chǎn)生π→π*、n→σ*、n→π*三個吸收帶，n→π*吸收帶又稱R帶，落于近紫外或紫外光區(qū)。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮這類物質(zhì)與羧酸及羧酸的衍生物在結(jié)構(gòu)上的差異，因此它們n→π*吸收帶的光區(qū)稍有不同。羧酸及羧酸的衍生物雖然也有n→π*吸收帶，但是，羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接連結(jié)含有未共用電子對的助色團(tuán)，如-OH、-Cl、-OR等，由于這些助色團(tuán)上的n電子與羰基雙鍵的π電子產(chǎn)生n→π共軛，導(dǎo)致π*軌道的能級有所提高，但這種共軛作用并不能改變n軌道的能級，因此實(shí)現(xiàn)n→π*躍遷所需的能量變大，使n→π*吸收帶藍(lán)移至210nm左右。4，苯及其衍生物苯有三個吸收帶，它們都是由π→π*躍遷引起的。E1帶出現(xiàn)在180nm（εMAX=60，000）；E2帶出現(xiàn)在204nm（εMAX=8，000）；B帶出現(xiàn)在255nm（εMAX=200）。在氣態(tài)或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜帶有許多的精細(xì)結(jié)構(gòu)，這是由于振動躍遷在基態(tài)電子上的躍遷上的疊加而引起的。在極性溶劑中，這些精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。當(dāng)苯環(huán)上有取代基時，苯的三個特征譜帶都會發(fā)生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B譜帶。5，稠環(huán)芳烴及雜環(huán)化合物稠環(huán)芳烴，如奈、蒽、芘等，均顯示苯的三個吸收帶，但是與苯本身相比較，這三個吸收帶均發(fā)生紅移，且強(qiáng)度增加。隨著苯環(huán)數(shù)目的增多，吸收波長紅移越多，吸收強(qiáng)度也相應(yīng)增加。當(dāng)芳環(huán)上的-CH基團(tuán)被氮原子取代后，則相應(yīng)的氮雜環(huán)化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光譜，與相應(yīng)的碳化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與奈相似。此外，由于引入含有n電子的N原子的，這類雜環(huán)化合物還可能產(chǎn)生n→π*吸收帶。二、無機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜產(chǎn)生無機(jī)化合物紫外、可見吸收光譜的電子躍遷形式，一般分為兩大類：電荷遷移躍遷和配位場躍遷。（一）電荷遷移躍遷無機(jī)配合物有電荷遷移躍遷產(chǎn)生的電荷遷移吸收光譜。在配合物的中心離子和配位體中，當(dāng)一個電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關(guān)的軌道上時，可產(chǎn)生電荷遷移吸收光譜。不少過度金屬離子與含生色團(tuán)的試劑反應(yīng)所生成的配合物以及許多水合無機(jī)離子，均可產(chǎn)生電荷遷移躍遷。此外，一些具有d10電子結(jié)構(gòu)的過度元素形成的鹵化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于這類躍遷而產(chǎn)生顏色。電荷遷移吸收光譜出現(xiàn)的波長位置，取決于電子給予體和電子接受體相應(yīng)電子軌道的能量差。（二）配位場躍遷配位場躍遷包括d-d躍遷和f-f躍遷。元素周期表中第四、五周期的過度金屬元素分別含有3d和4d軌道，鑭系和錒系元素分別含有4f和5f軌道。在配體的存在下，過度元素五個能量相等的d軌道和鑭系元素七個能量相等的f軌道分別分裂成幾組能量不等的d軌道和f軌道。當(dāng)它們的離子吸收光能后，低能態(tài)的d電子或f電子可以分別躍遷至高能態(tài)的d或f軌道，這兩類躍遷分別稱為d-d躍遷和f-f躍遷。由于這兩類躍遷必須在配體的配位場作用下才可能發(fā)生，因此又稱為配位場躍遷。三、溶劑對紫外、可見吸收光譜的影響溶劑對紫外—可見光譜的影響較為復(fù)雜。改變?nèi)軇┑臉O性，會引起吸收帶形狀的變化。例如，當(dāng)溶劑的極性由非極性改變到極性時，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，吸收帶變向平滑。改變?nèi)軇┑臉O性，還會使吸收帶的最大吸收波長發(fā)生變化。下表為溶劑對亞異丙酮紫外吸收光譜的影響。正己烷CHCl3CH3OHH2Oπ→π*λmax/nm230238237243n→π*λmax/nm329315309305由上表可以看出，當(dāng)溶劑的極性增大時，由n→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶發(fā)生藍(lán)移，而由π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶發(fā)生紅移。因此，在測定紫外、可見吸收光譜時，應(yīng)注明在何種溶劑中測定。由于溶劑對電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數(shù)據(jù)表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對照時也應(yīng)注明所用的溶劑是否相同。在進(jìn)行紫外光譜法分析時，必須正確選擇溶劑。選擇溶劑時注意下列幾點(diǎn)：（1）溶劑應(yīng)能很好地溶解被測試樣，溶劑對溶質(zhì)應(yīng)該是惰性的。即所成溶液應(yīng)具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。（2）在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶劑。（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)應(yīng)無明顯吸收。第三節(jié)紫外-可見分光光度計一、組成部件紫外-可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)是由五個部分組成：即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號指示系統(tǒng)。（一）光源對光源的基本要求是應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射，有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化應(yīng)盡可能小。分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340~2500nm。這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)，在可見光區(qū)，輻射的能量與工作電壓4次方成正比。光電流與燈絲電壓的n次方（n1）成正比。因此必須嚴(yán)格控制燈絲電壓，儀器必須配有穩(wěn)壓裝置。在近紫外區(qū)測定時常用氫燈和氘燈。它們可在160~375nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強(qiáng)度比相同功率的氫燈要大3~5倍。（二）單色器單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測定的靈敏度度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據(jù)不同的波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350~3200nm的波長范圍，即只能用于可見光域內(nèi)。石英棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從185~4000nm，即可用于紫外、可見和近紅外三個光域。光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是各級光譜會重疊而產(chǎn)生干擾。入射、出射狹縫，透鏡及準(zhǔn)光鏡等光學(xué)元件中狹縫在決定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過小的狹縫又會減弱光強(qiáng)。（三）吸收池吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。在高精度的分析測定中（紫外區(qū)尤其重要），吸收池要挑選配對。因?yàn)槲粘夭牧系谋旧砦馓卣饕约拔粘氐墓獬涕L度的精度等對分析結(jié)果都有影響。（四）檢測器檢測器的功能是檢測信號、測量單色光透過溶液后光強(qiáng)度變化的一種裝置。常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。硒光電池對光的敏感范圍為300~800nm，其中又以500~600nm最為靈敏。這種光電池的特點(diǎn)是能產(chǎn)生可直接推動微安表或檢流計的光電流，但由于容易出現(xiàn)疲勞效應(yīng)而只能用于低檔的分光光度計中。光電管在紫外-可見分光光度計上應(yīng)用較為廣泛。光電倍增管是檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力。（五）信號指示系統(tǒng)它的作用是放大信號并以適當(dāng)方式指示或記錄下來。常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動記錄裝置等。很多型號的分光光度計裝配有微處理機(jī)，一方面可對分光光度計進(jìn)行操作控制，另一方面可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。二、紫外-可見分光光度計的類型紫外-可見分光光度計的類型很多，但可歸納為三種類型，即單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。1，單光束分光光度計經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。2，雙光束分光光度計經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。3，雙波長分光光度計由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長（λ1和λ2）的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值ΔA（ΔA=Aλ1-Aλ2）。對于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通過光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，使雙波長分光光度計能很方便地轉(zhuǎn)化為單波長工作方式。如果能在λ1和λ2處分別記錄吸光度隨時間變化的曲線，還能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)研究。三、分光光度計的校正通常在實(shí)驗(yàn)室工作中，驗(yàn)收新儀器或?qū)嶒?yàn)室使用過一段時間后都要進(jìn)行波長校正和吸光度校正。建議采用下述的較為簡便和實(shí)用的方法來進(jìn)行校正：鐠銣玻璃或鈥玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來校正分光光度計的波長標(biāo)尺，前者用于可見光區(qū)，后者則對紫外和可見光區(qū)都適用。也可用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正吸光度標(biāo)度。定性分析紫外－可見分光光度法是一種廣泛應(yīng)用的定量分析方法，也是對物質(zhì)進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析的一種手段，同時還可以測定某些化合物的物理化學(xué)參數(shù)，例如摩爾質(zhì)量、配合物的配合比和穩(wěn)定常數(shù)、以及酸、堿的離解常數(shù)等。紫外－可見分光光度法在無機(jī)元素的定性分析應(yīng)用方面是比較少的，無機(jī)元素的定性分析主要用原子發(fā)射光譜法或化學(xué)分析法。在有機(jī)化合物的定性分析鑒定及結(jié)構(gòu)分析方面，由于紫外－可見光譜較為簡單，光譜信息少，特征性不強(qiáng)，而且不少簡單官能團(tuán)在近紫外及可見光區(qū)沒有吸收或吸收很弱，因此，這種方法的應(yīng)用有較大的局限性。但是它適用于不飽和有機(jī)化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。此外，它可配合紅外光譜法、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法等常用的結(jié)構(gòu)分析法進(jìn)行定量鑒定和結(jié)構(gòu)分析，是不失為一種有用的輔助方法。一般定性分析方法有如下兩種：1.比較吸收光譜曲線法吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目和位置及相應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)，是定性分析的光譜依據(jù)，而最大吸收波長及相應(yīng)的是定性分析的最主要參數(shù)。比較法有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較法和標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較法兩種。利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，在相同的測量條件下，測定和比較未知物與已知標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜曲線，如果兩者的光譜完全一致，則可以初步認(rèn)為它們是同一化合物。為了能使分析更準(zhǔn)確可靠，要注意如下幾點(diǎn)：一、是盡量保持光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)。為此，應(yīng)采用與吸收物質(zhì)作用力小的非極性溶劑，且采用窄的光譜通帶；二、是吸收光譜采用對作圖。這樣如果未知物與標(biāo)準(zhǔn)物的濃度不同，則曲線只是沿軸平移，而不是象曲線那樣以的比例移動，更便于比較分析。三、是往往還需要用其它方法進(jìn)行證實(shí)，如紅外光譜等。利用標(biāo)準(zhǔn)譜圖或光譜數(shù)據(jù)比較。常用的標(biāo)準(zhǔn)譜圖有以下表中的四種：[1]SadtlerStandardSpectra(Ultraviolet),Heyden,London,1978.薩特勒標(biāo)準(zhǔn)圖譜共收集了46000種化合物的紫外光譜。[2]R.A.FriedelandM.Orchin,“UltravioletandVisibleAbsorptionSpectraofAromaticCompounds”,Wiley,NewYork,1951.本書收集了597種芳香化合物的紫外光譜。[3]KenzoHirayama：“HandbookofUltravioletandVisibleAbsorptionSpectraaofOrganicCompounds.”,NewYork,Plenum,1967。[4]“OrganicElectronicSpectralData”。2.計算不飽和有機(jī)化合物最大吸收波長的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則有伍德沃德（Woodward）規(guī)則和斯科特（Scott）規(guī)則。當(dāng)采用其它物理或化學(xué)方法推測未知化合物有幾種可能結(jié)構(gòu)后，可用經(jīng)驗(yàn)規(guī)則計算它們最大吸收波長，然后再與實(shí)測值進(jìn)行比較，以確認(rèn)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。伍德沃德規(guī)則它是計算共軛二烯、多烯烴及共軛烯酮類化合物π—π*躍遷最大吸收波長的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則，如表13.7和表13.9所示。計算時，先從未知物的母體對照表得到一個最大吸收的基數(shù)，然后對連接在母體中π電子體系(即共軛體系)上的各種取代基以及其他結(jié)構(gòu)因素按上所列的數(shù)值加以修正，得到該化合物的最大吸收波長。。結(jié)構(gòu)分析紫外－可見分光光度法可以進(jìn)行化合物某些基因的判別、共軛體系及構(gòu)型、構(gòu)象的判斷。1.某些特征集團(tuán)的判別有機(jī)物的不少基團(tuán)(生色團(tuán))，如羰基、苯環(huán)、硝基、共軛體系等，都有其特征的紫外或可見吸收帶，紫外－可見分光光度法在判別這些基團(tuán)時，有時是十分有用的。如在270～300nm處有弱的吸收帶，且隨溶劑極性增大而發(fā)生藍(lán)移，就是羰基n－π*躍遷所產(chǎn)生R吸收帶的有力證據(jù)。在184nm附近有強(qiáng)吸收帶(E1帶)，在204nm附近有中強(qiáng)吸收帶(E2帶)，在260nm附近有弱吸收帶且有精細(xì)結(jié)構(gòu)(B帶)，是苯環(huán)的特征吸收，等等?？梢詮挠嘘P(guān)資料中查找某些基團(tuán)的特征吸收帶。2.共軛體系的判斷共軛體系會產(chǎn)生很強(qiáng)的K吸收帶，通過繪制吸收光譜，可以判斷化合物是否存在共軛體系或共軛的程度。如果一化合物在210nm以上無強(qiáng)吸收帶，可以認(rèn)為該化合物不存在共軛體系；若在215～250nm區(qū)域有強(qiáng)吸收帶，則該化合物可能有兩至三個雙鍵的共軛體系，如1－3丁二烯，為217nm，為21,000；若260～350nm區(qū)域有很強(qiáng)的吸收帶，則可能有三至五個雙鍵的共軛體系，如癸五烯有五個共軛雙鍵，為335nm，為118,000。3.異構(gòu)體的判斷包括順反異構(gòu)及互變異構(gòu)兩種情況的判斷。順反異構(gòu)體的判斷生色團(tuán)和助色團(tuán)處在同一平面上時，才產(chǎn)生最大的共軛效應(yīng)。由于反式異構(gòu)體的空間位阻效應(yīng)小，分子的平面性能較好，共軛效應(yīng)強(qiáng)。因此，及都大于順式異構(gòu)體。例如，肉桂酸的順、反式的吸收如下：＝280nm=13500＝295nm=27000同一化學(xué)式的多環(huán)二烯，可能有兩種異構(gòu)體：一種是順式異構(gòu)體；另一種是異環(huán)二烯，是反式異構(gòu)體。一般來說，異環(huán)二烯的吸收帶強(qiáng)度總是比同環(huán)二烯來的大?；プ儺悩?gòu)體的判斷某些有機(jī)化合物在溶液中可能有兩種以上的互變異構(gòu)體處于動態(tài)平衡中，這種異構(gòu)體的互變過程常伴隨有雙鍵的移動及共軛體系的變化，因此也產(chǎn)生吸收光譜的變化。最常見的是某些含氧化合物的酮式與烯醇式異構(gòu)體之間的互變。例如乙酰乙酸乙酯就是和烯醇式兩種互變異構(gòu)體：它們的吸收特性不同：酮式異構(gòu)體在近紫外光區(qū)的為272nm(為16)，是n－π*躍遷所產(chǎn)生R吸收帶。烯醇式異構(gòu)體的為243nm(為16000)，是π－π*躍遷出共軛體系的K吸收帶。兩種異構(gòu)體的互變平衡與溶劑有密切關(guān)系。在象水這樣的極性溶劑中，由于可能與H2O形成氫鍵而降低能量以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，所以酮式異構(gòu)體占優(yōu)勢:而象乙烷這樣的非極性溶劑中，由于形成分子內(nèi)的氫鍵，且形成共軛體系，使能量降低以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，所