TCIFST 017-2023 葡萄球菌腸毒素測(cè)定 ELISA試劑盒法

ⅠT/CIFST017—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位:北京市疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所、澳優(yōu)乳業(yè)(中國(guó))有限公司、北京三元食品股份有限公司、拜發(fā)分析系統(tǒng)銷(xiāo)售(北京)有限公司。廖冰君。1T/CIFST017—2023葡萄球菌腸毒素測(cè)定ELISA試劑盒法1范圍本文件規(guī)定了食品及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中葡萄球菌腸毒素測(cè)定的酶聯(lián)免疫吸附ELISA試劑盒方法。本文件適用于食品及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中葡萄球菌腸毒素及其分型的定性測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.10食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3方法原理樣品中游離的葡萄球菌腸毒素(抗原)與微孔中包被的抗體特異性結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物。將未與抗體結(jié)合的物質(zhì)充分洗去,用酶標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記,在酶反應(yīng)底物/發(fā)色劑的作用下,微孔中的液體由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色。反應(yīng)結(jié)束后,加入終止液終止反應(yīng),這時(shí)微孔中的液體由藍(lán)色變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀[(450nm±10nm)/(620nm±10nm)]測(cè)量微孔溶液的吸光度,樣品中葡萄球菌腸毒素含量與吸光度成正比。4設(shè)備和材料4.1葡萄球菌腸毒素檢測(cè)試劑盒RIDASCREENSETTotal(見(jiàn)附錄A)。4.2葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)試劑盒RIDASCREENSETA、B、C、D、E(見(jiàn)附錄B)。4.3酶標(biāo)儀:(450nm±10nm)/(620nm±10nm)。4.4分析天平:感量0.01g。4.5均質(zhì)器/振蕩器。4.6培養(yǎng)箱:37℃±1℃。4.7冷凍離心機(jī):≥3500r/min,≤10℃。4.8離心管50mL:玻璃或聚丙烯材質(zhì)。4.9單道移液器:20μL~200μL,100μL~1000μL。4.10八道移液器:30μL~300μL。4.11冰箱:冷藏5℃±3℃,冷凍≤-18℃。4.12pH計(jì):25℃條件下精度為0.01。4.13無(wú)菌濾膜:0.22μm。2T/CIFST017—20234.14無(wú)菌注射器:10mL。5試劑和培養(yǎng)基5.1實(shí)驗(yàn)用水:符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水要求。5.2PBS緩沖液:8.70gNaCl、0.55gNaH2PO4·H2O、2.85gNa2HPO4·2H2O,用水定容至1L,調(diào)pH至7.4。5.31×洗滌緩沖液:按照1∶10比例稀釋10×洗滌緩沖液濃縮液。稀釋后的1×洗滌緩沖液可在2℃~8℃保存1周。若10×洗滌緩沖液濃縮液稀釋前有結(jié)晶,需在37℃水浴鍋中加熱至完全溶解后再配置。5.4正庚烷:分析純。5.5腦心浸液培養(yǎng)基(BHI):10.0g胰蛋白胨、2.0g葡萄糖、5.0g牛心粉、5.0g氯化鈉、2.5g磷酸氫二鈉(12H2O),用水定容至1L,加熱煮沸至完全溶解,分裝試管,121℃高壓滅菌15min備用。6檢測(cè)程序N葡萄球菌腸毒素檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。NFS799)8")99)852"99)852"F5*KU&-*4"U99)852"4圖1葡萄球菌腸毒素檢測(cè)程序7操作步驟7.1樣品前處理7.1.1食品樣品7.1.1.1液態(tài)樣品(如生鮮乳、巴氏殺菌乳、調(diào)制乳、飲料等)充分混勻待檢樣品,吸取樣品10mL~25mL,3500r/min10℃離心10min,完全去除脂肪層,取上清液進(jìn)行檢測(cè),并將待檢樣品的pH控制在7.0±0.5范圍內(nèi)。7.1.1.2粉狀樣品(如嬰幼兒配方粉、乳粉、調(diào)制乳粉、食品原料等)3T/CIFST017—2023充分混勻待檢樣品,稱(chēng)取10g~25g進(jìn)行均質(zhì)之后稱(chēng)取1g加入10mL無(wú)菌蒸餾水,漩渦混勻,3500r/min10℃離心10min,完全去除脂肪層,取上清液進(jìn)行檢測(cè)(結(jié)果以溶解后的液體計(jì)),并將待檢樣品的pH控制在7.0±0.5范圍內(nèi)。7.1.1.3脂肪含量小于40%的樣品(如米、面及其制品,豆制品等)充分混勻待檢樣品,稱(chēng)取10g~25g均質(zhì)后按每克樣品加入1.5mLPBS緩沖液的比例(例如10g樣品+15mLPBS緩沖液),振蕩混合15min,3500r/min10℃離心10min,完全去除脂肪層,取上清液進(jìn)行檢測(cè)。7.1.1.4脂肪含量大于等于40%的樣品(如肉制品等)充分混勻待檢樣品,稱(chēng)取10g~25g均質(zhì)后按每克樣品加入1.5mLPBS緩沖液的比例(例如10g樣品+15mLPBS緩沖液),振蕩混合15min,3500r/min10℃離心10min,取一定量上清液移至另一個(gè)離心管中,加入與所取上清液相同體積的正庚烷,充分混合5min,3500r/min10℃離心10min,完全去除上層庚烷層,取下層清液進(jìn)行檢測(cè)。7.1.2金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液將純培養(yǎng)的待測(cè)金黃色葡萄球菌接種于腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)過(guò)夜培養(yǎng)。取1.5mL~2mL培養(yǎng)液置于離心管中,3500r/min10℃離心5min,將上清液用無(wú)菌注射器和無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌,取濾液進(jìn)行檢測(cè)。7.2葡萄球菌腸毒素檢測(cè)7.2.1將預(yù)先包被有葡萄球菌腸毒素特異性抗體的微孔條(見(jiàn)附錄A)插入微孔板架(見(jiàn)附錄A),標(biāo)記樣品液、陰性質(zhì)控液(見(jiàn)附錄A)和陽(yáng)性質(zhì)控液(見(jiàn)附錄A)的位置。7.2.2在相應(yīng)的微孔中分別加入100μL處理好的樣品液、陰性質(zhì)控液及陽(yáng)性質(zhì)控液。蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。7.2.3取出微孔板,倒去微孔中的液體,每個(gè)微孔加入300μL1×洗滌緩沖液洗滌,混合靜置后倒去洗滌液,拍干微孔板(力度適中)。重復(fù)上述步驟5次(可由自動(dòng)洗板機(jī)完成)。7.2.4洗板后,每個(gè)微孔加入100μL酶標(biāo)記物1溶液(見(jiàn)附錄A),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。7.2.5取出微孔板,進(jìn)行第2次洗板(按照7.2.3操作)。7.2.6洗板后,每個(gè)微孔加入100μL酶標(biāo)記物2溶液(見(jiàn)附錄A),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育30min。7.2.7取出微孔板,進(jìn)行第3次洗板(按照7.2.3操作)。7.2.8洗板后,每個(gè)微孔加入100μL底物/發(fā)色劑(見(jiàn)附錄A),水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,蓋上微孔板,35℃~37℃避光孵育15min。7.2.9取出微孔板,每個(gè)微孔加入100μL終止液,水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,30min之內(nèi)讀取(450nm±10nm)/(620nm±10nm)波長(zhǎng)下吸光度(OD)。7.3葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)7.3.1將預(yù)先包被有抗體的微孔板條(見(jiàn)附錄B)按照A—H的方向插入微孔板架(見(jiàn)附錄B),每一件待測(cè)樣品使用一條微孔板條。7.3.2在微孔板條A~G孔中各加入100μL處理好的樣品液,在H孔加入100μL陽(yáng)性質(zhì)控液(見(jiàn)附錄B),輕輕混勻后,蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。7.3.3取出微孔板,倒去微孔中的液體,每個(gè)微孔加入300μL1×洗滌緩沖液洗滌,混合靜置后倒去洗滌液,拍干微孔板(力度適中)。重復(fù)上述步驟5次(可由自動(dòng)洗板機(jī)完成)。7.3.4洗板后,每個(gè)微孔加入100μL酶標(biāo)記物1溶液(見(jiàn)附錄B),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育1h。4T/CIFST017—20237.3.5取出微孔板,進(jìn)行第2次洗板(按照7.3.3操作)。7.3.6洗板后,每個(gè)微孔加入100μL酶標(biāo)記物2溶液(見(jiàn)附錄B),蓋上微孔板,35℃~37℃孵育30min。7.3.7取出微孔板,進(jìn)行第3次洗板(按照7.3.3操作)。7.3.8洗板后,每個(gè)微孔加入100μL底物/發(fā)色劑(見(jiàn)附錄B),水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,蓋上微孔板,35℃~37℃避光孵育15min。7.3.9取出微孔板,每個(gè)微孔加入100μL終止液,水平方向輕搖微孔板使微孔中的液體充分混合,30min之內(nèi)讀取(450nm±10nm)/(620nm±10nm)波長(zhǎng)下吸光度(OD)。8結(jié)果與報(bào)告8.1檢測(cè)有效性判定陽(yáng)性質(zhì)控孔的吸光度(OD)應(yīng)≥1.0,陰性質(zhì)控孔的吸光度(OD)應(yīng)≤0.2,如果不能同時(shí)滿足以上要求,檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。8.2檢出限8.2.1食品樣品:液態(tài)樣品及溶解后的粉狀樣品0.25ng/mL,其他樣品0.375ng/g(mL)。8.2.2金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液0.25ng/mL。8.3臨界值計(jì)算8.4結(jié)果判定及報(bào)告8.4.1葡萄球菌腸毒素檢測(cè)若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)<臨界值,報(bào)告未檢出葡萄球菌腸毒素。若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)≥臨界值,報(bào)告檢出葡萄球菌腸毒素。8.4.2葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)<臨界值,報(bào)告未檢出某型葡萄球菌腸毒素。若結(jié)果顯示樣品吸光度(OD)≥臨界值,報(bào)告檢出某型葡萄球菌腸毒素。9質(zhì)量控制9.1實(shí)驗(yàn)前應(yīng)確認(rèn)試劑盒有效期,如陽(yáng)性質(zhì)控孔的吸光度(OD)<1.0或底物/發(fā)色劑在使用前顏色變藍(lán)則表明試劑已失效,不得使用。9.2若檢測(cè)結(jié)果的吸光度(OD)超出儀器讀值的線性范圍,則需要用PBS緩沖液稀釋培養(yǎng)物上清液,重新檢測(cè)。9.3當(dāng)葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)同時(shí)檢出兩種或兩種以上腸毒素時(shí),按附錄C對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行修正。9.4金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液前處理(除離心操作外)、葡萄球菌腸毒素定性及分型檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。5T/CIFST017—20239.5在稱(chēng)量、均質(zhì)樣品和葡萄球菌腸毒素檢測(cè)三個(gè)實(shí)驗(yàn)階段分別佩戴新的一次性乳膠手套。10生物安全按照GB19489處理實(shí)驗(yàn)廢棄物。6T/CIFST017—2023(規(guī)范性)葡萄球菌腸毒素檢測(cè)試劑盒A.1試劑盒組成葡萄球菌腸毒素檢測(cè)試劑盒RIDASCREENSETTotal包括:A.1.1預(yù)包被葡萄球菌腸毒素多價(jià)抗體的可拆分微孔板:8×12孔;A.1.2陽(yáng)性質(zhì)控液:2mL/瓶×1瓶;A.1.3陰性質(zhì)控液:2mL/瓶×1瓶;A.1.410×洗滌緩沖液濃縮液:100mL/瓶×1瓶;A.1.5酶標(biāo)記物1溶液:11mL/瓶×1瓶;A.1.6酶標(biāo)記物2溶液:11mL/瓶×1瓶;A.1.7底物/發(fā)色劑:13mL/瓶×1瓶;A.1.8終止液:14mL/瓶×1瓶。A.2試劑盒保存及使用A.2.1試劑盒于2℃~8℃黑暗處避光保存,使用前回復(fù)至室溫(20℃~25℃);使用完盡快放回2℃~8℃,不可冷凍。未使用的微孔板孔,必須與袋中的干燥劑一起,重新放入鋁箔封口袋中并封好,2℃~8℃保存。A.2.2不同批號(hào)試劑盒中組分不得混用。A.2.3超過(guò)有效期的試劑盒不得使用。7T/CIFST017—2023附錄B(規(guī)范性)葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)試劑盒B.1試劑盒組成葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)試劑盒RIDASCREENSETA、B、C、D、E包括:B.1.1可拆分微孔板(8×12孔):A~E孔預(yù)包被葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E型特異性抗體,H孔預(yù)包被葡萄球菌腸毒素多價(jià)抗體,F和G孔預(yù)包被非葡萄球菌腸毒素的特異性抗體;B.1.2陽(yáng)性質(zhì)控液:2mL/瓶×1瓶;B.1.310×洗滌緩沖液濃縮液:100mL/瓶×1瓶;B.1.4酶標(biāo)記物1溶液:11mL/瓶×1瓶;B.1.5酶標(biāo)記物2溶液:11mL/瓶×1瓶;B.1.6底物/發(fā)色劑:13mL/瓶×1瓶;B.1.7終止液:14mL/瓶×1瓶。B.2試劑盒保存及使用B.2.1試劑盒于2℃~8℃黑暗處避光保存,使用前回復(fù)至室溫(20℃~25℃);使用完盡快放回2℃~8℃,不可冷凍。未使用的微孔板孔,必須與袋中的干燥劑一起,重新放入鋁箔封口袋中并封好,2℃~8℃保存。B.2.2不同批號(hào)試劑盒中組分不得混用。B.2.3超過(guò)有效期的試劑盒不得使用。8T/CIFST017—2023附錄C(規(guī)范性)葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)結(jié)果修