感染管理環(huán)境衛(wèi)生學(xué)采樣及檢查方法

感染管理環(huán)境衛(wèi)生學(xué)采樣及消毒滅菌效果監(jiān)測SOP根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》GB15979-2002、《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》GB15982—1995及《內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)操作規(guī)范（2004年版）》等規(guī)定，特制定蘭大一院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)采樣及消毒滅菌效果監(jiān)測SOP。一、空氣消毒效果的監(jiān)測1.1采樣時間:在消毒處理后或進行醫(yī)療活動之前采樣。采樣高度：距地面垂直高度80～150cm1.2采樣方法：A:非層流房間(1)布點方法:室內(nèi)面積≤30m2，設(shè)內(nèi)、中、外對角線布3點，內(nèi)、外點布點部位距墻壁1m處；室內(nèi)面積＞30m2，設(shè)4角及中央5點，4角的布點部位距墻壁1m處。(2)采樣方法:將普通營養(yǎng)瓊脂平板(直徑為9cm)放在室內(nèi)各采樣點處，采樣高度為距地面1.5m采樣時將平板蓋打開，扣放于平板旁，暴露5min，蓋好立即送檢。B：層流房間層流房間應(yīng)在空態(tài)或靜態(tài)條件下采樣，根據(jù)房間不同凈化級別進行布點，操作按照GB50333-2002,9cm直徑普通營養(yǎng)瓊脂平板在采樣點暴露30min后送檢培養(yǎng)。1.3檢測方法:細菌菌落總數(shù)檢查：將已采樣完畢的培養(yǎng)皿在6h內(nèi)送進實驗室，置于37度溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，計算菌落總數(shù)，1.4計算結(jié)果：非層流房間：按照公式計算：細菌總數(shù)（cfu/m3）=50000N/（A×T）＝菌落數(shù)×157式中A為平板面積（cm2）；T為平板暴露時間（min）；N為平均菌落數(shù)（cfu）。層流房間直接以個/30min.90mm皿為單位計算結(jié)果1.5結(jié)果判定非層流房間：Ⅰ類區(qū)域：細菌總數(shù)≤10cfu/m3(或0.2cfu/平板)，未檢出金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌為消毒合格；Ⅱ類區(qū)域：細菌總數(shù)≤200cfu/m3(或4cfu/平板)，未檢出金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌為消毒合格；Ⅲ類區(qū)域：細菌總數(shù)≤500cfu/m3(或10cfu/平板)，未檢出金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌為消毒合格。層流房間：按照GB50333-2002要求判定二、物品和環(huán)境表面消毒效果的監(jiān)測2.1采樣時間:在消毒處理后4h內(nèi)進行采樣。消毒后的采樣一定要采用中和劑，不同消毒劑所用中和劑則不同。2.2采樣面積及采樣方法:用5cm×5cm的標準滅菌規(guī)格板，放在被檢物體表面，采樣面積≥100cm2，連續(xù)采樣4個，用浸有含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液的棉拭子1支，在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉(zhuǎn)棉拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子投入10ml含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液試管內(nèi)，立即送檢，送檢時間不得超過6h。門把手等不規(guī)則物體表面用棉拭子直接涂擦采樣。2.3檢測方法(1)細菌總數(shù)檢測:將采樣管在混勻器上振蕩20s或用力振打80次，用無菌吸管吸取1.0ml待檢樣品接種于滅菌平皿，每一樣本接種2個平皿，內(nèi)加入已溶化的45℃～48℃的營養(yǎng)瓊脂15ml～18ml，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，置36℃±1℃溫箱培養(yǎng)48h，計數(shù)菌落數(shù)。采樣結(jié)果計算方法：平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)細菌總數(shù)(cfu/cm2)＝────────────────＝菌落數(shù)×0.10采樣面積(cm2)小型物體表面的結(jié)果計算，用cfu/件表示。2.4結(jié)果判定Ⅰ、Ⅱ類區(qū)域：細菌總數(shù)≤5cfu/cm2，并未檢出致病菌為消毒合格。Ⅲ類區(qū)域細菌：總數(shù)≤10cfu/cm2，并未檢出致病菌為消毒合格。Ⅳ類區(qū)域細菌：總數(shù)≤15cfu/cm2，并未檢出致病菌為消毒合格。母嬰同室、早產(chǎn)兒室、嬰兒室、新生兒室及兒科病房的物體表面不得檢出沙門菌。三、醫(yī)護人員手及皮膚黏膜采樣及檢查方法3.1采樣時間：在接觸患者、進行診療活動前采樣。3.2采樣方法(1)手的采樣:被檢者五指并攏，用浸有含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液浸濕的棉拭子在雙手指曲面從指根到指端往返涂擦2次，一只手涂擦面積約30cm2，涂擦過程中同時轉(zhuǎn)動棉拭子；將棉拭子接觸操作者的部分剪去，投入10ml含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液試管內(nèi)，及時送檢。(2)皮膚粘膜采樣:用5cm×5cm的標準滅菌規(guī)格板，放在被檢皮膚處，用浸有含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液的棉拭子1支，在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子投入10ml含相應(yīng)中和劑的無菌洗脫液的試管內(nèi)，立即送檢。不規(guī)則的粘膜皮膚處可用棉拭子直接涂擦采樣。3.3細菌菌落總數(shù)檢查將采樣管在混勻器上振蕩20s或用力振打80次，用無菌吸管吸取1.0ml待檢樣品接種于滅菌平皿，每一樣本接種2個平皿，內(nèi)加入已溶化的45℃～48℃的營養(yǎng)瓊脂15ml～18ml，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，置36℃±1℃溫箱培養(yǎng)48h，計數(shù)菌落數(shù)。3.4采樣結(jié)果計算方法：細菌總數(shù)(cfu/cm2)＝平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/采樣面積(cm2)＝菌落數(shù)×0.17(2)致病菌檢測:按九的原則執(zhí)行3.5結(jié)果判定：a)衛(wèi)生手消毒，監(jiān)測的細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤10cfu/cm2。b)外科手消毒，監(jiān)測的細菌菌落總數(shù)應(yīng)≤5cfu/cm2。四、消毒液的監(jiān)測1）涂抹法:用無菌吸管吸取消毒液1.0ml，加入9.0ml含有相應(yīng)中和劑的采樣管內(nèi)混勻，用無菌吸管吸取上述溶液0.2ml，滴于干燥普通瓊脂平板，每份樣品同時做2個平行樣，一平板置20℃培養(yǎng)7d，觀察霉菌生長情況，另一個平板置35℃溫箱培養(yǎng)72h記數(shù)菌落數(shù)，同時按八的原則檢測致病菌。消毒液染菌量(cfu/ml)＝每個平板上的菌落數(shù)×502）傾注法：用無菌吸管吸取消毒液1.0ml，加入到9.0ml含相應(yīng)中和劑的無菌生理鹽水采樣管中混勻，分別取0.5ml放入2只滅菌平皿內(nèi)，加入已熔化的45℃～48℃的營養(yǎng)瓊脂15ml～18ml，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，一平板置20℃培養(yǎng)7d，觀察霉菌生長情況;另一個平板置36℃±1℃培養(yǎng)72h，計數(shù)菌落數(shù)，同時按九的原則檢測致病菌。消毒液染菌量(cfu/ml)＝每個平板上的菌落數(shù)×20(2)結(jié)果判斷：消毒液染菌量≤100cfu/ml，并未檢出致病菌為合格。(3)注意事項：采樣后1h內(nèi)檢測。五、內(nèi)鏡消毒滅菌效果的監(jiān)測5.1采樣時間：在消毒滅菌后、使用前進行采樣。5.2采樣方法：監(jiān)測采樣部位為內(nèi)鏡的內(nèi)腔面。用無菌注射器抽取10ml含相應(yīng)中和劑的緩沖液，從待檢內(nèi)鏡活檢口注入，用15ml無菌試管從活檢出口收集，及時送檢，2小時內(nèi)檢測。

5.3菌落計數(shù)：將送檢液用旋渦器充分震蕩，取0.5ml，加入2只直徑90mm無菌平皿，每個平皿分別加入已經(jīng)熔化的45℃-48℃營養(yǎng)瓊脂15ml-18ml，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，于35℃培養(yǎng)48小時后計數(shù)。

結(jié)果判斷：菌落數(shù)/鏡=2個平皿菌落數(shù)平均值×20。致病菌檢測：將送檢液用旋渦器充分震蕩，取0.2ml分別接種90mm血平皿、中國蘭平皿和SS平皿，均勻涂布，35℃培養(yǎng)48小時，觀察有無致病菌生長。

5.4結(jié)果判定:消毒后的內(nèi)鏡合格標準為：細菌總數(shù)<20cfu/件，不能檢出致病菌；滅菌后內(nèi)鏡合格標準為：無菌檢測合格。六、透析液6.1采樣時間：隨機檢測6.2采樣方法：用5mL無菌空針在所監(jiān)測透析機的透析液入口處，抽取1mL透析液，無菌方式直接送檢到微生物實驗室，以便及時檢測。6.3檢驗科所用材料無菌試管、平皿、吸管（1.0mL、10.0mL）;無菌0.9%氯化鈉溶液、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（加羊血）。6.4檢測方法用無菌吸管吸取透析用水2.0-3.0mL，放入無菌試管，檢測時視透析用水污染程度分別取原液或10倍稀釋液0.5mL放入2個滅菌平皿內(nèi)，45℃-48℃的營養(yǎng)瓊脂15-18mL，邊傾注邊搖勻、待瓊脂凝固，將平板置37℃培養(yǎng)24小時，計數(shù)并鑒定細菌。透析用水細菌總數(shù)CFU/mL=2個平板上的菌落總數(shù)×稀釋倍數(shù)七、致病菌的檢測7.1檢測原則:致病菌的檢測依據(jù)污染情況進行相應(yīng)指標的檢測。7.2金黃色葡萄球菌檢測。(1)增菌、分離取采樣液1ml，接種于5mlSCDLP液體培養(yǎng)基中，于36℃±1℃增菌24h。取1白金耳上述增菌液，在血平板上作劃線分離，36℃±1℃培養(yǎng)24h。(2)觀察菌落特征:在血瓊脂平板上菌落形態(tài)為金黃色、圓形凸起、表面光滑、周圍有溶血圈。(3)鏡檢:挑取典型菌落作涂片染色鏡檢，鏡下為革蘭陽性、成葡萄狀排列的球菌。(4)生化反應(yīng):取可疑菌落作觸酶、葡萄糖發(fā)酵、血漿凝固酶、甘露醇發(fā)酵、新生霉素敏感試驗，均為陽性者即為金黃色葡萄球菌。1）甘露醇發(fā)酵試驗：取上述可疑菌落接種于甘露醇培養(yǎng)基，于36℃±1℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽性。2）血漿凝固試驗：①玻片法：潔凈玻片一端滴一滴滅菌生理鹽水，另一端滴一滴血漿，用白金耳挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混勻，５min內(nèi)觀察有無固體顆粒狀物，若血漿出現(xiàn)凝塊，生理鹽水均勻混濁為陽性，兩者均混濁為陰性。②試管法：吸取1:4新鮮血0.5ml，放在滅菌小試管中，再加入等量待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物，混勻后放入36℃±1℃孵箱中，同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌肉湯培養(yǎng)物作對照，每30s.觀察一次，６h內(nèi)出現(xiàn)凝塊者為陽性。7.3乙型溶血性鏈球菌檢測(1)增菌、分離:取樣品1ml，接種于1％葡萄糖肉湯，37℃增菌24h。取1白金耳增菌液在血平板上作劃線分離，36℃±1℃培養(yǎng)24h。(2)觀察菌落特征:菌落形態(tài)為灰白色、半透明或不透明、針尖狀突起、表面光滑、邊緣整齊、周圍有β溶血圈。(3)鏡檢:挑取典型菌落作涂片染色鏡檢，鏡下為革蘭陽性、呈鏈狀排列的球菌。(4)生化反應(yīng):取可疑菌落作如下生化試驗，如觸酶陰性、鏈激酶試驗陽性、對桿菌肽敏感者，即為乙型溶血性鏈球菌。鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿0.2ml（0.02g草酸鉀加5ml人血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清），加入0.8ml滅菌生理鹽水混勻后再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml，混勻，放入36℃±1℃水浴中，每２min觀察一次（一般10min內(nèi)可凝固），待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化的時間，如２h內(nèi)不溶化，移入孵箱觀察24h的結(jié)果，如全部溶化為陽性；24h仍不溶解者為陰性。桿菌肽敏感試驗：將被檢菌濃菌液涂于血平板上，用滅菌鑷子取含菌0.04單位桿菌肽紙片放在平板表面上。同時以已知陽性菌株作對照，于36℃±1℃18h～24h，有抑菌帶者為陽性。7.4沙門菌檢測:參照GB4789.4(食品中沙門菌檢測方法)。7.5試劑與培養(yǎng)基的配制：按附錄A進行。附錄A中和劑的配置要求根據(jù)：醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準GB15982-1995中規(guī)定醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養(yǎng)肉湯即可；含氯消毒劑、含碘消毒劑、過氧化物消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉；洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在肉湯中加入3%（W/V）吐溫80和0.3%卵磷脂；醛類消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸；含有表面活性劑的各種復(fù)方消毒劑，需在肉湯中加入3%（W/V）吐溫80，以中和被檢樣液的殘效作用。1、磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）無水磷酸氫二鈉2.83g磷酸二氫鉀1.36g蒸餾水加至1000ml將各成分加入到1000ml蒸餾水中，待完全溶解后，調(diào)pH至7.2～7.4，分裝，每管10Ml,于121℃壓力蒸氣滅菌20min備用。2、硫代硫酸鈉中和劑（0.1-1.0%）pH7.2-7.40.03mol/L磷酸鹽緩沖液100ml硫代硫酸鈉0.1-1.0g溶解后分裝，每管10mL,用于物表監(jiān)測，9mL的用于消毒液染菌量檢測，于121℃壓力蒸氣滅菌15min備用。3、吐溫80中和劑（0.5-1.0%）pH7.2-7.40.03mol/L磷酸鹽緩沖液100ml吐溫800.5-1.0g于121℃壓力蒸氣滅菌15min備用。4、無菌試驗洗脫液