河北省職業(yè)院校技能大賽生物技術(shù)賽項(xiàng)（GZ023）樣題模塊二 生物活性物質(zhì)的提取與鑒定考核

（該模塊占45%，考試時(shí)間100分鐘）一、利用磁珠法提取血液基因組DNA進(jìn)行生物活性物質(zhì)提取與鑒定（共1題，計(jì)100分）1．考核題目取100μl雞全血血液，利用磁珠法分離純化高質(zhì)量DNA，并通過(guò)超微量分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行DNA濃度與純度測(cè)定（完成3次平行實(shí)驗(yàn)），計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄和數(shù)據(jù)分析，完成結(jié)果報(bào)告。DNA濃度與純度檢測(cè)結(jié)果計(jì)算公式：（1） DNA濃度計(jì)算按OD260為1相當(dāng)于50μg/mL雙鏈DNA、40μg/mL單鏈DNA，進(jìn)行計(jì)算。（2） DNA純度檢測(cè)OD260/OD280比值應(yīng)為1.7至1.9。（3） 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式根據(jù)三個(gè)樣品DNA含量測(cè)定值，計(jì)算出RSD。式中：x——三次DNA含量測(cè)定值的平均值，單位為毫克每千克（μg/mL）；n——平行樣品個(gè)數(shù)，為3；xi——每個(gè)樣品的測(cè)定值。2.考核內(nèi)容考核實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、基因組DNA提取的實(shí)驗(yàn)操作、上機(jī)檢測(cè)進(jìn)行DNA濃度和純度測(cè)定，實(shí)驗(yàn)記錄、數(shù)據(jù)分析與結(jié)果報(bào)告、清潔與整理等五方面。3.考核要求實(shí)驗(yàn)前，需要穿戴實(shí)驗(yàn)工作服（帽子、口罩、衣服、鞋套）、手套，做好實(shí)驗(yàn)前儀器材料準(zhǔn)備和檢查工作，確認(rèn)工作環(huán)境情況。實(shí)驗(yàn)操作全程熟練掌握移液器使用。使用磁珠法提取雞血DNA，安全、穩(wěn)定完成裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫等各步驟操作。熟練使用渦旋儀、磁力架、水浴鍋、超微量分光光度計(jì)等儀器設(shè)備。準(zhǔn)確記錄儀器測(cè)定數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（使用賽場(chǎng)提供的計(jì)算器），完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告等。還原比賽工位，清潔與整理。二、操作要求1、確認(rèn)漂洗液和緩沖液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照試劑盒瓶上的標(biāo)簽。2、取雞全血樣品100μl于離心管中，加入20μlProteinaseK溶液3、加入300μl裂解液GHL，振蕩混勻。4、將離心管置于恒溫混勻器，適宜溫度（65-70℃）孵育約15min，期間顛倒混勻3回，每回3-5次。5、室溫放置5min。6、加入350μl異丙醇，震蕩混勻10s。7、加入20μl磁珠懸浮液，振蕩混勻1min，共靜置9min，每3min振蕩混勻1min（為了確保磁珠徹底重懸，請(qǐng)?jiān)谑褂们罢袷幓靹颍?、將離心管放置于磁力架上靜置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液體。9、將離心管從磁力架取下，加入700μl緩沖液GDA（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），振蕩混勻5min。10、將離心管放置于磁力架上靜置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液體。注：可選做重復(fù)步驟9和10。11、將離心管從磁力架上取下，加入700μl漂洗液PWD，振蕩混勻2min。12、將離心管放置于磁力架上靜置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液體。13、重復(fù)步驟11，12一次。14、將離心管于磁力架上，室溫晾干。15、將離心管從磁力架上取下，加入洗脫緩沖液100μlTB，振蕩混勻，置于56℃，孵育5-10min，期間顛倒混勻3回，每回3-5次。16、將離心管放置于磁力架上靜置2min，磁珠完全吸附后，小心將DNA溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新離心管中，并于適當(dāng)條件保存。17、用超微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA含量和純度。河北省職業(yè)院校技能大賽生物技術(shù)賽項(xiàng)（GZ023）樣題模塊二生物活性物質(zhì)的提取與鑒定考核河北省職業(yè)院校技能大賽生物技術(shù)賽項(xiàng)