第二章 菌種的來源課件

第二章：菌種的來源微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一些工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌種的特點自然界中有目的微生物分離的原則菌種選育、分子育種第二章菌種的來源第一節(jié)微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長

有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝

有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長第二章菌種的來源二：工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求第二章菌種的來源放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動物來源一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：第二節(jié)已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第二章菌種的來源二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉(zhuǎn)折點：第二章菌種的來源HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶第二章菌種的來源氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌第二章菌種的來源三、食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物開發(fā)一個新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗。關(guān)于食品用酶，美國需要得到FDA的批準(zhǔn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌第二章菌種的來源三、常用的基因表達(dá)系統(tǒng)(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門氏菌

生長迅速、蛋白產(chǎn)量高;

表達(dá)蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導(dǎo)入相對容易；

已建立了整套表達(dá)理論及技術(shù).第二章菌種的來源(二)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

酵母(既是微生物又是真核細(xì)胞)

生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；

安全性好；

比哺乳動物細(xì)胞操作簡單；

具有一定的修飾蛋白的能力。第二章菌種的來源

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)

具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能；

具有產(chǎn)物胞外分越功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；

具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；

具有貼壁生長特性，也可進(jìn)行懸浮生長；

CHO很少分泌自身的內(nèi)源蛋白。第二章菌種的來源微生物（包括動、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛力。問題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：第二章菌種的來源第三節(jié)自然界中有目的微生物分離的原則一、菌種分離的一般過程土樣的采取→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：第二章菌種的來源二、采樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結(jié)合產(chǎn)品的特點

標(biāo)簽：地點、時間、氣候等第二章菌種的來源富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分類學(xué)中考慮，

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法第二章菌種的來源定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養(yǎng)的方法第二章菌種的來源定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。第二章菌種的來源四、菌落的選出

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。第二章菌種的來源實例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選（國家七五攻關(guān)項目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻(xiàn):產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍(lán)＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型↓第二章菌種的來源例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落第二章菌種的來源五、目的微生物富集方法的研究進(jìn)展

分子生物學(xué)的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。

2002,陳文新（科學(xué)院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第二章菌種的來源第四節(jié)菌株選育、分子改造目的

提高生產(chǎn)能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量

開發(fā)新產(chǎn)品

解決生產(chǎn)實際問題

防止菌種退化第二章菌種的來源方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進(jìn)化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等第二章菌種的來源自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、自然選育第二章菌種的來源自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？第二章菌種的來源自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗第二章菌種的來源二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{第二章菌種的來源（二）、誘變劑處理過程中幾個有關(guān)的問題

化學(xué)誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（一）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH第二章菌種的來源（三）、誘變育種的一般步驟(p83)（四）、篩選的方法

隨機篩選

形態(tài)

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。第二章菌種的來源HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型第二章菌種的來源黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l第二章菌種的來源三、基因的直接進(jìn)化(directedevolution)

突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因復(fù)制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標(biāo)基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。第二章菌種的來源主要應(yīng)用：酶學(xué)性能的提高:pH

溫度

有機溶劑生理環(huán)境→工業(yè)催化環(huán)境

底物專一性第二章菌種的來源脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學(xué)拆分選擇性(%)231577581905次錯位PCR2次定點突變Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌種的來源第二章菌種的來源定點突變第二章菌種的來源錯位PCR第二章菌種的來源DNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(SexualRecombination)。第二章菌種的來源XXXX

XXXX

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XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling第二章菌種的來源項目進(jìn)化速度進(jìn)化對象進(jìn)化周期影響對象