檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

摘要近年來，隨著胚胎工程技術(shù)的深入研究和全面的商業(yè)化推廣以及養(yǎng)牛行業(yè)的蓬勃發(fā)展，人們對(duì)于牛胚胎需求越來越大。解決這一問題的方法之一便是牛卵母細(xì)胞體外成熟。氧化應(yīng)激是影響牛卵母細(xì)胞體外成熟的重要因素。為緩解氧化應(yīng)激造成的不良影響，通常在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或自由基清除劑來維持卵母細(xì)胞的氧化還原平衡。本試驗(yàn)旨在探究在牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育過程中添加檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響。通過對(duì)分裂率，谷胱甘肽（GSH）水平，活性氧（ROS）水平，以及四種抗氧化相關(guān)基因（SOD1、SOD3、SIRT1、SIRT3）的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，對(duì)照組卵裂率顯著低于Lim處理組（P<0.05）；對(duì)照組ROS水平顯著高于Lim處理組（P<0.05）；對(duì)照組GSH水平顯著低于Lim處理組（P<0.05）；相比于對(duì)照組檸檬苦素可以顯著提高SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3的表達(dá)水平（P<0.05）。綜上，Lim能夠有效地降低氧化應(yīng)激損傷，提高牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力。關(guān)鍵詞：檸檬苦素；牛；卵母細(xì)胞；體外成熟；氧化應(yīng)激目錄摘要 [7]。研究表明，檸檬苦素等高度氧化的三萜類化合物的結(jié)構(gòu)中羥基較少，因此具有氧化活性[13]YuJ，WangL，WalzemＲlmillerEG，etal．Antioxidantactivityofcitruslimonoids，flavonoids，andcoumarins［J］．JAgricFoodChem，2005，53(6):2009-2014.13]。檸檬苦素的抗氧化能力在腦組織中也可以表達(dá)，試驗(yàn)表明檸檬苦對(duì)自然衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善能力[14]李林子，胡文敏，唐靚，等.檸檬苦素對(duì)自然衰老大鼠抗氧化和學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2016，(01):22-27.14][9]孟鵬.金柑檸檬苦素類化合物的提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究［D］．福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2013.[10]董文博,王雪瑩,楊洲.檸檬苦素的性質(zhì)及其生理功能的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵科技,2012,48(02):1-4.[11]TianQ，MillerEG，AhmadH，etal．Differentialinhibitionofhumancancercellproliferationbycitruslimonoids［J］．NutrCancer，2001，40(2):180-184.[12]QianP，JinHW，YangXW.NewlimonoidsfromCoptidisＲhizoma-EuodiaeFructuscouple［J］．JAsianNatProdＲes，2014，16(4):333-344.[13]YuJ，WangL，WalzemＲlmillerEG，etal．Antioxidantactivityofcitruslimonoids，flavonoids，andcoumarins［J］．JAgricFoodChem，2005，53(6):2009-2014.[14]李林子，胡文敏，唐靚，等.檸檬苦素對(duì)自然衰老大鼠抗氧化和學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2016，(01):22-27.[15]MokbelMS，HashinagaF.Evaluationoftheantioxidantactivityofextractsfrombuntan(CitrusgrandisOsbeck)fruittissues［J］．FoodChem，2006，94(4):529-534.1.3研究的目的和意義胚胎移植技術(shù)是人工授精技術(shù)后的又一次重大突破，對(duì)動(dòng)物科學(xué)研究以及畜牧業(yè)都是具有重大意義的偉大提升。而胚胎移植的效果取決與卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量。體外培養(yǎng)過程中，會(huì)有許多應(yīng)激損傷損害卵母細(xì)胞，氧化應(yīng)激是其中最大也是最常見的一種威脅。本研究中，在牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系中把檸檬苦素作為抗氧化劑添加，通過分析檸檬苦素影響氧化應(yīng)激水平的效果，來探究添加檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的發(fā)育質(zhì)量的影響，為卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化，胚胎移植效率的提高提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。第二章材料與方法2.1試驗(yàn)藥品與儀器2.1.1試驗(yàn)主要儀器儀器型號(hào) 公司超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FDTELSTAR二氧化碳培養(yǎng)箱CO170S-230-0000ASTEC高溫滅菌鍋MJ-54ASTIK高速離心機(jī)D3024Thermo烘干箱BAO-80ASTIK熒光顯微鏡C-SHG1NIKON電熱恒溫水浴鍋XMTD203Thermo電子天平AS220.R2RADWAG實(shí)體顯微鏡SZ61NIKON渦旋混合器STD-09022TThermo﹣80℃冰箱ULTS1368Thermo磁力加熱攪拌器1522031ESCOPCR儀Mx3000/5PBIORAD2.1.2試驗(yàn)藥品主要試驗(yàn)藥品試劑中文名英文名或縮寫公司檸檬苦素LimoninSigma雙抗P-SSigma胎牛血清FBSGibco組織培養(yǎng)液TCM-199Sigma體外受精液IVF100Sigma表皮生長因子EGFSigma氯化鈉NaClSigma雌二醇E2Sigma丙酮酸鈉PySigma碳酸氫鈉NaHCO3Sigma氯化鈣CaCl2Sigma磷酸二氫鈉NaH2PO4Sigma卵泡刺激素FSHSigma半胱氨酸CySigma葡萄糖GlucoseSigma氯化鉀KClSigma六水氯化鎂MgCl2·6H2OSigma牛血清白蛋白BSASigma肝素HeparinSigma4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPESSigma慶大霉素GentamycinSigma非必需氨基酸MEMSigma谷氨酰胺L-glutamineSigma咖啡因CaffeineSigma必需氨基酸BMESigmaL（+）-乳酸L(+)-LactateSigma透明質(zhì)酸酶HySigma礦物油MineralOilSigma

2.1.3藥品配制試驗(yàn)所用藥品全程在超凈工作上使用去離子水完成配置，培養(yǎng)液PH值均在7.3-7.4之間，配制完成后使用0.22μm的過濾器過濾。1%BSA-PBS：取BSA0.4g，加入到40mlPBS溶液中，震蕩溶解后過濾。在4℃保存?zhèn)溆谩?%Hy酸酶濃縮液：取Hy0.2g，加入到20mlTCM-199中，震蕩溶解后過濾。在-20℃保存?zhèn)溆?。無菌生理鹽水：取NaCl9g，青霉素500μl，鏈霉素500μl，加入到1L蒸餾水中，震蕩溶解。常溫保存?zhèn)溆?。IVF100：分裝后4℃保存?zhèn)溆谩?早期胚胎培養(yǎng)液（IVC）成分見下表名稱英文縮寫濃度氯化鉀KCl0.2300mg/ml氯化鈉NaCl6.7000mg/ml牛血清白蛋白BSA4.0000mg/ml碳酸氫鈉NaHCO32.2000mg/ml慶大霉素Gentamycin0.0500mg/ml谷氨酰胺L-glutamine0.1500mg/ml必需氨基酸BME2%L（+）-乳酸L(+)-Lactate0.5500mg/ml非必需氨基酸MEM1%丙酮酸鈉Na-pyruate0.0400mg/ml牛卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）培養(yǎng)液成分見下表名稱英文縮寫濃度培養(yǎng)液TCM-19950ml表皮生長因子EGF10ng/ml胎牛血清FBS10%雙抗P-S1%卵泡刺激素FSH0.04mg/ml丙酮酸鈉Py0.022g/ml雌二醇E21mg/ml精子激活液（BO）成分見下表名稱英文縮寫濃度氯化鈉NaCl6.6300mg/ml氯化鉀KCl0.2996mg/ml氯化鈣CaCl20.2506mg/ml葡萄糖Glucose2.5050mg/ml牛血清白蛋白BSA5.0000mg/ml4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES2.9786mg/ml碳酸氫鈉NaHCO32.1000mg/ml磷酸二氫鈉NaH2PO40.1178mg/ml六水合氯化鎂MgCl2·6H2O0.1055mg/ml咖啡因Caffeine3.8840mg/ml丙酮酸鈉Na-pyruate0.1300mg/ml肝素Heparin0.0100mg/ml2.2卵母細(xì)胞的來源在屠宰場等待母牛宰殺后，迅速將卵巢取下，使用30-35℃的無菌生理鹽水進(jìn)行沖洗。沖洗干凈后裝入保溫瓶中，浸泡在30-35攝氏度的無菌生理鹽水在1h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后先將手和卵巢消毒，將卵巢多余的肉在超凈工作臺(tái)上割除。在卵巢表面用吸水紙擦拭，然后使用裝有18號(hào)針頭的5毫升注射器抽取卵巢上表面直徑為2-8毫米的卵泡。離心管中加入抽取的卵泡液，室溫下沉淀10min后將上清液棄除，將3mlB-IVM培養(yǎng)液加入沉淀物中。在顯微鏡下挑選形態(tài)正常且卵丘細(xì)胞層致密的卵子。2.3卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)在挑選完成后，隨機(jī)將卵子分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)滴中加入20μM檸檬苦素，未添加檸檬苦素的為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在無菌培養(yǎng)箱中用38℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)24h。2.4卵母細(xì)胞體外受精在檸檬苦素組和對(duì)照組的IVM中分別加入200μL的0.5%透明質(zhì)酸酶（Hy），輕輕吹打5次以達(dá)成去除部分卵丘細(xì)胞的目的，在體外受精液（IVF100）中將卵母細(xì)胞清洗5次后放入100μLIVF100中使用礦物油覆蓋；將精子從液氮內(nèi)取出，在38℃水浴鍋中解凍5s。在BO中加入解凍的精子，25℃，1000rpm離心5min后將上清液棄除，加入BO再離心一次。將卵母細(xì)胞與離心后沉淀的精子放入IVF100中，在5%CO2，38.5℃二氧化碳培養(yǎng)箱共培養(yǎng)6h。 2.5卵母細(xì)胞的胚胎培養(yǎng)受精結(jié)束后，在1.5mL容量的離心管中注入1mL的0.1%透明質(zhì)酸酶，其中放置揀出的卵母細(xì)胞。為去除全部卵丘細(xì)胞，使用1000μL槍吹打30次。在含有0.4%的BSA-CRI培養(yǎng)基中清洗受精卵5次后放入10μLBSA-CRI中并用礦物油覆蓋。放入38.5℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后檢查分裂率。2.6 卵母細(xì)胞ROS水平的檢測與試驗(yàn)操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，將裸卵放置在200μL濃度為10μmol/L細(xì)胞追蹤綠色熒光染料H2DCFDA中。隨后實(shí)驗(yàn)避光操作，在37℃恒溫板上孵育染色，30min后清洗裸卵。在熒光顯微鏡下使用綠色熒光進(jìn)行觀察并拍攝。2.7卵母細(xì)胞GSH水平的檢測與試驗(yàn)操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，將裸卵放置在200μL濃度為10μmol/L細(xì)胞追蹤藍(lán)色熒光染料CMF2HC中。隨后實(shí)驗(yàn)避光操作，在37℃恒溫板上孵育染色，30min后清洗裸卵。在熒光顯微鏡下使用藍(lán)色熒光進(jìn)行觀察并拍攝。 2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR與試驗(yàn)操作2.3-2.5相同，取得裸卵，用1%BSA-PBS清洗2-3次后，在50μL裂解緩沖液中放入裸卵進(jìn)行裂解。隨后在冰上開始嚴(yán)格無菌操作，根據(jù)說明書使用DynaBeadsmRNADirectKit（Cat#61012,DynalAsa,Oslo,Norway）試劑盒提取mRNA。接下來使用DynaBeadsmRNADirectKit（LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA）試劑盒將提好的mRNA逆轉(zhuǎn)錄38min獲得cDNA。再使用KAPASYBR?FAST試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，PCR反應(yīng)采用20μl體系。qPCR反應(yīng)使用CFXConnectOpticsModulePCR儀，預(yù)變性95℃3min，95°C3s，60°C30s，72°C20s，擴(kuò)增目的基因?yàn)?0個(gè)循環(huán)。使用內(nèi)參為GAPDH，目的基因?yàn)镾OD1、SOD3、SIRT1、SIRT3。PCR引物序列如表所示，RNA的定量數(shù)據(jù)使用2?ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；騁ene引物序列Primersequences(5'-3')SOD1F:ATCCACTTCGAGGCAAAGGGR:TGTCACATTGCCCAGGTCTCSOD3F:TTGCGATTTTATAGGGTCGTAR:AACGCCCGAACTAAAACGATSIRT1F:TGGCCAGCTAGACTTGCAAAR:AACTTGGACTCTGGCACGTTSIRT3F:CACAGTCTGCCAAAGACCCTR:AGAACACAATGTCGGGCTTCGAPDHF:GCACCACTGGCATTGTCATGR:CCATCTCCTGCTCGAAGTCC2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析熒光強(qiáng)度分析使用Image-J軟件。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS18.0軟件，試驗(yàn)組與對(duì)照組使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，形成表圖使用GraphPadPrism6.01軟件。肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著（P>0.05）；肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）。 第三章結(jié)果3.1檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響為了探究檸檬苦素對(duì)牛胚胎發(fā)育的影響，在試驗(yàn)組添加檸檬苦素20μM，普通培養(yǎng)基作為對(duì)照組。經(jīng)過體外成熟，受精和培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)早期胚胎的分裂率。如圖3.1所示，經(jīng)過檸檬苦素處理的實(shí)驗(yàn)組分裂率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。說明檸檬苦素對(duì)胚胎發(fā)育有著促進(jìn)作用。圖3.1檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞發(fā)育的影響（A）24h卵母細(xì)胞分裂情況，標(biāo)尺：200μm；（B）分裂率，R=3；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異（P<0.05）Fig.3.1effectofLimoninonbovineoocytedevelopment(a)24hoocytedivision，Scalebar:200μm；(b)divisionrate,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.2活性氧（ROS）熒光強(qiáng)度分析 為了探究檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，將檸檬苦素添加到IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，檢測卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。在ROS熒光強(qiáng)度分析中，顏色越明亮則ROS相對(duì)水平越高。由圖3.2可知，對(duì)照組ROS水平顯著高于Lim處理組（P<0.05）。由此可知檸檬苦素對(duì)早期胚胎培養(yǎng)過程中的活性氧（ROS）具有一定的清除能力。圖3.2檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞ROS水平的影響。（A）ROS熒光染色圖片，標(biāo)尺：200μm（B）ROS相對(duì)水平，R=3；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異（P<0.05）Fig.3.2effectofLimoninonROSlevelofbovineoocytes.(A)ROSfluorescencestainingpictureScalebar:200μm；(b)relativelevelofROS,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.3谷胱甘肽（GSH）熒光強(qiáng)度分析為了進(jìn)一步探究檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，將檸檬苦素添加到IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，檢測卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的水平。在GSH熒光分析中，顏色越明亮則GSH相對(duì)水平越高。由圖3.3可知，對(duì)照組GSH水平顯著低于Lim處理組（P<0.05）。由此可知檸檬苦素可以顯著提高早期胚胎發(fā)育過程中谷胱甘肽（GSH）的相對(duì)水平。圖3.3檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞GSH水平的影響。（A）GSH熒光染色圖片，標(biāo)尺：200μm（B）GSH相對(duì)水平，R=3；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異（P<0.05）Fig.3.3effectofLimoninonGSHlevelofbovineoocytes.(A)GSHfluorescencestainingpicture，Scalebar:200μm(b)GSHrelativelevel,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05)3.4抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量為了深入探究檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，將檸檬苦素添加到IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，檢測了卵母細(xì)胞中抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平:SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3。相比于對(duì)照組檸檬苦素可以顯著提高SOD1、SOD3、SIRT1和SIRT3的表達(dá)水平（P<0.05）。圖3.4檸檬苦素對(duì)牛卵母細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的影響。RT-PCR分析抗氧化相關(guān)基因SOD1、SOD3、SIRT2和SIRT3的mRNA水平，R=3；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異（P<0.05）。Fig.2.2.6effectofLIMonantioxidantrelatedgenesinbovineoocytes.ThemRNAlevelsofantioxidantrelatedgenesSOD1,SOD3,sirt2andSIRT3wereanalyzedbyRT-PCR,r=3;Differentlettersindicatestatisticallysignificantdifferences(P<0.05).第四章討論檸檬苦素是在柑橘的皮和種子中含量豐富的一種氧化性四環(huán)三萜類有機(jī)物。經(jīng)過大量試驗(yàn)驗(yàn)證，具有優(yōu)秀的抑菌效果和抗氧化能力。本試驗(yàn)探討了在添加抗氧化劑檸檬苦素后對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明檸檬苦素能夠使ROS水平降低，使GSH水平和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)提高，以此降低氧化應(yīng)激對(duì)牛卵母細(xì)胞和胚胎的不利影響。4.1檸檬苦素對(duì)分裂率的影響分裂率是評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。也是評(píng)判對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育發(fā)育是否有影響最直接的指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，添加檸檬苦素可以顯著增加早期胚胎的分裂率。說明檸檬苦素對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育具有積極的促進(jìn)作用。4.2檸檬苦素對(duì)氧化應(yīng)激的作用比起體內(nèi)成熟，卵母細(xì)胞的體外成熟效率顯著偏低，氧化應(yīng)激是可能的一個(gè)原因[16]AgarwalA,

GuptaS,

SharmaRK.Roleofoxidativestressinfemalereproduction[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2005,3(1):1-21.。ROS對(duì)哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞以及胚胎的影響非常明顯，DNA在受到氧化應(yīng)激造成的損傷后有可能會(huì)發(fā)生DNA斷裂、基因突變以及雙螺旋結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性的改變等影響，同時(shí)自由基還會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的蛋白質(zhì)分子中的氨基酸成分造成損害，而且蛋白質(zhì)在經(jīng)過氧化后，熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性上也會(huì)變差，其中的部分三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)被打開，失去原有構(gòu)像后蛋白質(zhì)活性也會(huì)降低甚至失活[17]張申,衛(wèi)濤濤.生物大分子的氧化損傷與疾病[J].懷化醫(yī)專學(xué)報(bào),2006,5(1):81-84.。因此，卵母細(xì)胞正常發(fā)育的前提是確保ROS和抗氧化水平之間的動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)中觀察到添加檸檬苦素可以[16]AgarwalA,

GuptaS,

SharmaRK.Roleofoxidativestressinfemalereproduction[J].ReproductiveBiology&Endocrinology,2005,3(1):1-21.[17]張申,衛(wèi)濤濤.生物大分子的氧化損傷與疾病[J].懷化醫(yī)專學(xué)報(bào),2006,5(1):81-84.谷胱甘肽（GSH）是一種由甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸組成的三肽[18]冮潔,單立峰.谷胱甘肽的制備及其應(yīng)用[J].飼料工業(yè),2007(15):15-17.。GSH在細(xì)胞內(nèi)在多種有氧氣參與的反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用，在氧自由基發(fā)生積累時(shí)，氧自由基會(huì)與GSH的巰基相結(jié)合，氧自由基在GSH的催化下會(huì)被還原為酸性物質(zhì)，以此減少氧自由基的積累，使器官免受來自氧自由基的傷害[19]代濤,尹志峰,王良友.還原型谷胱甘肽臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,31(05):432-435.DOI:10.15921/ki.cyxb.2014.05.084.。GSH的主要功能是及時(shí)將氧自由基催化，減少ROS的積累[20]MyhrstadM,

CarlsenH,ONordstr?m,etal.Flavonoidsincreasetheintracellularglutathionelevelbytransactivationofthegamma-glutamylcysteinesynthetasecatalyticalsubunitpromoter.[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2002,32(5):386-393.。具有抗氧化特性的物質(zhì)在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中可增加細(xì)胞內(nèi)GSH的產(chǎn)生來防止氧化應(yīng)激造成的線粒體功能障礙和氧化損傷[21]Xiang-HongOu,,SenLi,Zhen-BoWang,MoLi,SongQuan,FuqiXing,LeiGuo,Shi-BinChao,ZijiangChen,Xing-WeiLiang,YiHou,HeideSchattenandQing-YuanSun,*.Maternalinsulinresistancecausesoxidativestressandmitochondrialdysfunctioninmouseoocytes[J].HumanReproduction,2012,27(7):p.2130-2145.。在本試驗(yàn)中，檸檬苦素提高GSH的水平[18]冮潔,單立峰.谷胱甘肽的制備及其應(yīng)用[J].飼料工業(yè),2007(15):15-17.[19]代濤,尹志峰,王良友.還原型谷胱甘肽臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,31(05):432-435.DOI:10.15921/ki.cyxb.2014.05.084.[20]MyhrstadM,

CarlsenH,ONordstr?m,etal.Flavonoidsincreasetheintracellularglutathionelevelbytransactivationofthegamma-glutamylcysteinesynthetasecatalyticalsubunitpromoter.[J].FreeRadicalBiology&Medicine,2002,32(5):386-393.[21]Xiang-HongOu,,SenLi,Zhen-BoWang,MoLi,SongQuan,FuqiXing,LeiGuo,Shi-BinChao,ZijiangChen,Xing-WeiLiang,YiHou,HeideSchattenandQing-YuanSun,*.Maternalinsulinresistancecausesoxidativestressandmitochondrialdysfunctioninmouseoocytes[J].HumanReproduction,2012,27(7):p.2130-2145.超氧化物歧化酶（SOD）是一種可以有效減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基積累的抗氧化金屬酶[22]石慧.半滑舌鰨對(duì)納米鋅、納米銅需求量的研究[D].天津農(nóng)學(xué)院,2016.。氧自由基會(huì)在SOD的催化發(fā)生歧化，生成過氧化氫和氧，因此它能抵抗氧毒性,增強(qiáng)機(jī)體抵抗輻射的能力,延緩衰老，在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的氧化與抗氧化的平衡中有著非常關(guān)鍵的影響[23]楊衛(wèi)健,張雙全.超氧化物歧化酶的研究及應(yīng)用前景[J].淮陰師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002(04):82-86.DOI:10.16119/ki.issn1671-6876.2002.04.021.。作為SOD基因家族的一員，SOD1是一種在細(xì)胞中分布廣泛的抗氧化酶[24]Yuewei,Sheng,Abreu,etal.SuperoxideDismutasesandSuperoxideReductases.[J].ChemicalReviews,2014.。SOD1可以結(jié)合ROS和氧氣直接在能量代謝中發(fā)揮作用[25]ReddiA,

CulottaV.SOD1IntegratesSignalsfromOxygenandGlucosetoRepressRespiration[J].Cell,2013,152(1-2):224-235.，作為核轉(zhuǎn)錄因子時(shí)可以對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行調(diào)控[26]TsangCK,LiuY,ThomasJ,etal.Superoxidedismutase1actsasanucleartranscriptionfactortoregulateoxidativestressresistance.NatCommun.2014Mar19;5:3446.。細(xì)胞外過氧化物歧化酶的編碼基因是SOD3基因。SOD3作為SOD基因家族中的一員，和其他SOD基因相同，可以減少體內(nèi)在代謝過程中所產(chǎn)生的活性氧（ROS）的積累，防止細(xì)胞被環(huán)境中超氧離子損傷。SOD3是SOD基因家族中唯一能在細(xì)胞外表達(dá)的基因，所以SOD3有著降低氧自由基對(duì)脈管系統(tǒng)造成損傷的重要作用[27]張寶,周玫,陳瑗.細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EcSOD)[J].醫(yī)學(xué)綜述,2000(08):340-341.。Sirtuin蛋白是一組組蛋白去乙酰化酶，可以對(duì)很多底物蛋白質(zhì)的表達(dá)、穩(wěn)定性與活性通過去乙?；饔眠M(jìn)行調(diào)控[28]霍曉芳,張俊武.Sirtuin:依賴NAD~+的去乙酰化酶[J].生命的化學(xué),2005(03):181-184.。Sirtuin家族基因與細(xì)胞老化，細(xì)