免疫組織化學傅琦博免疫組織化學

集團文件發(fā)布號：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-19882）集團文件發(fā)布號：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-19882）免疫組織化學傅琦博免疫組織化學免疫組織化學傅琦博引言酶工程是生物工程的重要組成部分，近幾十年來，隨著研究手段的更新和技術水平的提高，產生了一門以研究酶在細胞內的存在及其動態(tài)，以闡明組織細胞的結構和功能為主要內容的科學——酶組織化學。酶組織化學是利用酶化學反應的產物可在光學顯微鏡或電子顯微鏡下被識別的特性，借以從形態(tài)學角度判定酶在組織細胞內的存在的部位的一門技術，其基礎是組織化學。它具有將形態(tài)學、生物化學和生理學聯系起來的特點，在生物學、生物化學、醫(yī)學生物領域內日益發(fā)揮著重要的作用。研究組織細胞內特定酶分布的酶組織化學方法大致分為：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗體反應（免疫應答）證實酶的存在部位的方法。后者也被稱之為免疫組織化學。免疫組織化學概述免疫組織化學簡稱免疫組化，是應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分，進行原位的定性、定位或定量的研究。這種技術稱為免疫組織化學技術。免疫組化是利用抗體與抗原的結合具有高度特異性的特點，采用一直的抗體檢測組織或細胞的抗原物質，以期確定組織或細胞是否存在未知抗原，并進行定性、定位或定量的研究?？乖c抗體結合形成的免疫復合物是無色的，故必須借助組織化學方法，將抗體抗原反應部位顯示出來。它的主要研究方法是免疫組織染色法（簡稱免疫染色法），食用該方法檢測細胞內物質，必須具備兩個條件：①作為檢測對象的物質須具有抗原性，能制作出與之相應的特異、高效價的抗體；②在免疫反應發(fā)生之前，目標物質要保持抗原性，同時還要保持在組織細胞內的穩(wěn)定狀態(tài)。要檢測抗原，就要用與之相應的抗體進行免疫反應，同時要用可視的標記標出抗原或抗體，采用這種方法的免疫染色法稱為標識抗體法或標識抗原法，常用的表示抗體法有直接法、間接法、補體結合法以及多重染色法等。直接法是標識要檢出的抗原的抗體，然后進行反應的方法，其特異性高，但檢出的敏感度不如間接法，標識抗體的食用范圍手局限。間接法是以未標識的第一抗體進行反應，接著標識以第一抗體為抗原所制作的抗體（即第二抗體）進行重疊反應，間接的證明抗原，這種方法的缺點是容易出現非特異性反應，但敏感度較高，標識抗體的用途也廣；補體結合法是將間接法中的第二抗體作為標識抗補體抗體食用；多重染色法則是在同一標本上檢出多種抗原物質的方法，可以用反復進行的重復標記的直接法，也可以用酶標記的重復進行的間接法。此外，還有后標識抗體的免疫染色法，此法先采用未標識的抗體進行反應，反應結束后，通過免疫化學反應或其他化學反應，用適當的標記物質來識別已與組織細胞內抗原發(fā)生結合的抗體。免疫組織化學技術的發(fā)展免疫組織化學技術是形態(tài)學研究領域一門新興方法學。自它問世以來發(fā)展迅猛,用“日新月異”一詞形容它毫不過分。酶標免疫組織化學技術是由Nakane等人于60年代末期創(chuàng)立的最早的免疫酶組織化學技術,之后Sternberger等人于70年代初期便在此基礎上建立了非標記抗體酶法(又稱間接法)和PAP法(過氧化酶抗過氧化酶法)。80年代初期美籍華人Hsu又建立了卵白素生物素復合物法(ABC法),自此之后,免疫金銀染色法、免疫電鏡等技術相繼問世。80年代末期人們又發(fā)現鏈霉菌抗生物素蛋白(或譯成鏈霉菌親合素,Streptavidin)與生物素結合力極強,遂用它標記過氧化酶建立起了SP法,或稱LSAB法(鏈霉菌親合素生物素過氧化酶法)。由于鏈霉菌親合素不與人組織中的內源性生物素起非特異性結合反應,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC法高4～8倍,比PAP法高8～16倍。進入90年代,免疫組織化學又向基因水平深入發(fā)展,與分子生物學技術的結合日益緊密。如原位雜交后信號的放大與顯示便是采用了免疫組織化學顯色技術,因而又可稱之為原位雜交免疫組織化學技術。而圖象分析、流式細胞儀的運用，是免疫細胞化學定量分析技術提高到更精確的水平?，F就該技術的發(fā)展及其應用作一概述。1利用免疫熒光標記技術可以分辨出標記抗原抗體所在的位置及其性質,并可利用熒光定量技術計算抗原(或抗體)的含量,以達到對定性、定位、定量測定的目的[2]。如黃祥瑞等人(1999)利用免疫熒光細胞化學技術研究西藏環(huán)狀病毒細胞生物學特性和敏感細胞范圍(CPE),成功地觀察到該病毒的細胞病變效應特異熒光發(fā)生的部位、細胞數量和病毒的形態(tài)發(fā)生。辛德畢斯熱是由辛德畢斯病毒SindbisVirus(SiN)引起的人獸共患蟲媒病毒病,1974年南非發(fā)生辛德畢斯熱大流行。1991年梁國棟等通過免疫熒光技術首次從新疆分離到SiN病毒。1999年陳振光等利用間接免疫熒光試驗檢測到福建寧化林區(qū)人群、野兔、狐貍、狗存在SiN感染,抗體陽性率分別為12.86%、5.88%、14.29%、6.45%。因而判定福建寧化林區(qū)可能存在辛德畢斯熱自然疫源地。2抗生物素—生物素—過氧化酶復合物技術(AvidinBiotin2PeroxidaseComplextechnique,簡稱ABC技術)是Hsu等于1981年創(chuàng)立,其特點是利用抗生物素分別連接生物素標記的第二抗體和生物素標記的酶。該方法簡便、節(jié)約時間,敏感性、特異性高,背景染色淡。由于生物素與抗生物素具有與多種示蹤物結合的能力,可用于雙重或多重免疫染色。如李月白等采用ABC法研究發(fā)現絨毛層滋養(yǎng)細胞、絨毛中軸的基質細胞、毛細血管的內皮細胞、毛細血管腔內的淋巴細胞以及血島細胞均表現為P物質(SP)受體免疫反應陽性,陽性物質分布于胞質和胞膜上,胞核呈陰性反應。該研究為其對胎盤及胚胎發(fā)育的作用提供形態(tài)學依據。張雅萍在ABC法基礎之上改進,建立了生物素-抗生物素-過氧化物酶復合物(sABC)法,探討了IL28在甲狀腺腫瘤組織中的表達及意義。3葡萄球菌蛋白A(StaphylococalProteinA,SPA或SP)具有免疫特性,發(fā)展成為免疫學上一種極為有用的工具。其優(yōu)點是不受種屬特異性的限制,染色時間短、靈敏性高和背景染色淡等。故在目前各種免疫細胞化學技術中得到廣泛的應用。如肖華亮等[9]用此法檢測、探討骨肉瘤MDM2和p53蛋白定位、表達水平及相互關系和其對骨肉瘤轉移及預后的影響。應用SPA與膠體金或鐵蛋白相結合,可在電鏡水平檢查抗原抗體反應的定位。自Pomano和Romano(1977)首次報告用蛋白A-膠體金技術(ProteinA2Goldtechnique,PGA技術)標記細胞表面抗原、包括淋巴細胞、血小板、大鼠腎臟細胞及感染的病毒細胞獲得成功以來,SP法已得到愈來愈廣泛的應用,并發(fā)展成為一種較為理想的免疫電鏡技術。4堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶方法(簡稱APAAP法)克服了辣根過氧化酶(HRP)的不足。沈巖等用APAAP法結合單克隆抗體(mAb)KL21(廣譜抗人細胞角蛋白,德國)比較分析不同腫瘤細胞間同種細胞凝集力、靶器官定植力、細胞增殖和細胞凋亡現象、癌基因及腫瘤相關抗原表達等生物學特征。進一步明確腫瘤細胞相關生物學特性與腫瘤細胞轉移能力間的關系。而鏈霉素親和素(Streptavidin,SA)具有高度的親和力,利用生物素結合的二抗與酶標記的SA親和(LSAB法)是免疫組化中非常有用的方法。沈靖南等采用該法,檢測84例骨肉瘤中p2糖蛋白(p2gp)表達,半定量化計量p2gp的著色強度及陽性率,通過多因素相關分析和生存分析,探討骨肉瘤預后的相關因素和高危因素,研究骨肉瘤多藥耐藥性的表達與預后,并證實p2gp介導骨肉瘤的MDR現象,明確p2gp表達與肺轉移的關系。5凝集素((Phytoagglutin,PHA)作為一種探針研究細胞膜上特定的糖基,具有多價結合能力。直接將標記物標記在凝集素上,再與切片中的相應糖蛋白或糖脂相結合,該法簡便,但靈敏性不夠高。經研究發(fā)現將凝集素直接與切片中的相應糖基結合,可提高敏感性高5～10倍或更多一些,有人認為若將凝集素與特定的糖基作成三明治樣的糖2凝集素2糖的結合物,特異性、靈敏度將會更高。而且能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結合,從而在光鏡與或電鏡水平顯示其結合部位。Newman等(1979)以熒光素標記凝集素PHA實驗,發(fā)現在大鼠乳腺上皮的不同分化時期顯示不同的熒光強度。Kivela和Farkkanen(1987)用凝集素作為細胞特殊類型的標記實驗發(fā)現,在人視網膜上PHA標記視錐細胞而不標記視桿細胞。在乳腺、乳腺上皮細胞呈PHA陽性反應,而肌上皮細胞和間質細胞呈PHA陰性反應。他以多種凝集素對小鼠、大鼠和兔的腎組織切片進行染色結果表明,刀豆素A和蓖麻素存在于腎臟的各部,PHA和雙花扁豆凝集素(DBA)主要分布于遠曲小管和集合小管上皮細胞,荊豆凝集素(UEA)主要分布在血管內皮細胞,而麥芽素分布在腎小球。Streit和Kreutzberg(1987)發(fā)現GriffoniaSimplicifolia凝集素能特異性標記面神經節(jié)內的小膠質細胞,而其它類型的膠質細胞如星狀膠質細胞(Astro2cyte)等都顯示陰性反應。如果在切斷面神經后,增殖的小膠質細胞對GriffoniaSimplicifolia凝集素的反應加強。大量研究發(fā)現,凝集素可作為腫瘤組織源性的標記、腫瘤特異性診斷的標志、腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記。如張華忠等(1987)報道115例胃癌標記PHA陽性率高達90.43%,而正常胃粘膜基本是陰性,故認為PHA是胃癌的診斷性標志。BSA對乳腺惡性腫瘤陽性率達79%,而對良性病變均呈陰性反應,提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關標志。HRP本身雖含有甘露糖,能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結合。但對其它的凝集素,需要將糖基化(Glycosylation)過氧化物酶結合到該凝集素上,且糖基化過氧化物酶品種尚有限,故目前本法在應用還有一定困難。免疫細胞化學技術尚在繼續(xù)改進和完善中,除目前國內外已廣泛應用的免疫金技術和免疫金銀技術外,新的免疫細胞化學技術不斷出現。1984年國外學者首次將CRNA探針應用于原位雜交,核酸探針為單鏈的RNA分子,產生自具有質粒逆轉錄系統(tǒng)的cDNA克隆。在1987年Wolf等建議插入確定長度的寡核苷酸至載體內產生cRNA分子,這種cRNA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”(oligoribo－probes),現在已被廣泛的用于原位雜交實驗。國內的楊春花等采用免疫組化和cDNA2mRNA原位分子雜交技術分別檢測了24例RA,18例骨關節(jié)炎(OA)和6例正?；そM織中uPA,uPAR蛋白和mRNA的分布及表達情況?？蒲泄ぷ髡吒鶕庖呓M織化學中材料的特性把同位素、生物素、光敏生物素、酶促生物素、地高辛標記cRNA上成功的制成探針。尤其地高辛與放射性標記相比,標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點,對人體無害,不受半衰期限制,探針可長期保存;與生物素標記探針相比,不受組織、細胞中內源性生物素的干擾,敏感性、分辨率較高,反應產物顏色鮮艷,反差好,背景染色低,制備探針可較長期保存,對人體無害等優(yōu)點,已日益顯示出它的優(yōu)越性和廣泛的應用前景。并且進一步研究發(fā)現它能根據需要人工用DNA合成儀合成,其長度及分子大小比較一致,可控地高辛同位素寡核苷酸探針。另外,放射性同位素、熒光素、生物素也能成功標記寡核苷酸作為探針,成功地運用于培養(yǎng)細胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。雖然有些人認為其敏感度不如來自質粒擴增的cRNA或DNA探針,但由于探針制備簡便再加之于近年非放射性標記的成功,寡核苷酸探針在生物基礎醫(yī)學及臨床學科領域中得到較為廣泛的應用。免疫細胞化學技術與流式細胞術(FCM)結合進行多參數FCM分析血液淋巴細胞免疫表型(亞群)方法學因素對實驗結果的影響。當血液采集后1h和6h測定淋巴細胞免疫表型結果差異無顯著。如黃勇華等采用單標或雙標直接免疫熒光標記法標記20種細胞表面分化抗原,經流式細胞儀測定。后進行分析185例白血病患者骨髓或外周血白血病細胞的免疫分型及CD117的表達細胞表面分化抗原(CD)117在各型白血病中的表達及其意義。免疫細胞化學技術先進儀器和方法結合已呈現新的趨勢，如用熒光顯微分光光度計和圖像分析儀等定量檢測,將結果客觀打印、報告,這更適合于臨床診斷和科學研究。如楊希謙等采用非放射碘標記人直腸癌相關抗原單克隆抗體(McAb)技術與生物導向CT顯像進行腫瘤的免疫組化鑒定與免疫顯像研究。免疫組織化學技術在臨床病理診斷中的重要作用100年前發(fā)明的用光學顯微鏡觀察HE染色切片法仍然是當前各級醫(yī)院病理科中的基本方法。該方法的局限性在于僅能從細胞水平反映疾病性質,診斷中觀察者的主觀推測成份高,常常是同一疾病出現分歧頗大的數個不同診斷,多年來成為臨床病理診斷中的突出問題。而免疫組織化學方法是通過抗原抗體反應客觀地反映疾病性質,在觀察HE切片基礎上,再結合免疫組織化學染色結果可對某一疾病做出較為客觀公正的評價,從而可避免主觀因素的影響。自免疫組織化學技術應用于臨床病理診斷以來,在以下幾類疾病的鑒別診斷中發(fā)揮著重要作用。1高度未分化腫瘤細胞起源的鑒別:發(fā)生在胃腸道的這類腫瘤應首選CEA與Vimentin兩種抗體鑒別是上皮源性抑或是間葉源性腫瘤。因為CEA在消化道上皮源性腫瘤的陽性率高,但在鱗癌時陽性率低;而消化道以外部位發(fā)生者,上皮性標記物宜選用EMA,該抗體在90%以上上皮源性腫瘤呈陽性表達。2小圓細胞腫瘤的鑒別:小圓細胞腫瘤包括小細胞未分化癌、惡性淋巴瘤、小細胞軟組織肉瘤、神經內分泌腫瘤以及小細胞黑色素瘤。這類腫瘤鑒別診斷時應使用EMA或CEA,LCA,Vimentin,NSE,S100和HMB45抗體。3大細胞型腫瘤鑒別:這類腫瘤可以是大細胞未分化癌、低分化肉瘤、大細胞性黑色素瘤和大細胞性惡性淋巴瘤。在鑒別診斷時應該選用EMA或CEA,Vimentin,S100和LCA抗體。4梭形或多形性軟組織肉瘤的鑒別:此類腫瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形細胞血管肉瘤、梭形細胞黑色素瘤、多形性橫紋肌肉瘤、多形性惡性纖維組織細胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。以下抗體可用于鑒別診斷:Actin,EMA,FⅧAg,S100,MB45,Myoglobin,Desmin,α12AT以及α12ACT。5惡性淋巴瘤分型:在免疫組織化學研究領域，當前對惡性淋巴瘤的免疫組織化學研究最為活躍與細致。截止目前為止,已有下列亞型可以通過免疫組織化學染色確立。它們是:B細胞淋巴瘤,L26陽性,LN2陽性;T細胞淋巴瘤,MT1陽性,UCHL1陽性;NK細胞淋巴瘤C123C陽性;樹突網織細胞淋巴瘤,Ber2MAC2DRC陽性;指狀突網織細胞淋巴瘤,S100陽性;真性組織細胞淋巴瘤,Mac387陽性,Lysozyme陽性,α12ACT陽性;何杰金病R2S細胞,LeuM1陽性,Ber2H2陽性;大細胞間變型淋巴瘤Ber2H2(或稱Ki21)陽性。6神經內分泌腫瘤的確立:90%以上的神經內分泌腫瘤NSE陽性。由于NSE與其它腫瘤有交叉反應,故必要時可加染ChromograninA或Synaptophysin抗體。當需要弄清神經內分泌腫瘤有否內分泌功能時,再加染多肽類激素抗體。7腫瘤預后的推測:最早用于推測腫瘤預后的抗體有抗雌激素受體ER及抗孕激素受體PR,二者陽性時預后較好。新近又發(fā)現,轉移抑制基因產物nm23呈高表達時預后較好。而下列幾種抗體呈高表達時均提示預后差：C2erbB22,C2myc,P53,EGFR,PCNA,Ki267,BrdU,P120,P105。8感染性疾病病原體的檢測:其中HBsAg及HBcAg抗體常用于肝病研究與診斷。而尖銳濕疣及宮頸癌時常?？梢詸z測到乳頭狀瘤病毒HPV。鼻咽癌、何杰金病時EB病毒抗體多呈陽性。免疫組織化學技術由于它自身獨有的特點,使得廣大科研作者在組織細胞定位、定性、定量研究中經常選取的技術,因此隨著科研工具的更新,科研工作者對免疫組織化學更廣泛深入的理解、并與其他研究手段深入結合,優(yōu)化技術路線地設計,而推動免疫組織化學技術的進一步發(fā)展。如范少地等運用GAP243cDNA探針(生長相關蛋白243(Growthassociatedpro2tein43,GAP243)原位雜交技術來觀察這一變化過程中GAP243mRNA表達水平,陽性細胞定位及分布的變化。李月白等應用免疫組化LSAB法和原位雜交方法,觀察了骨肉瘤患者p21waf1cip1表達水平與臨床預后之間的關系。而倪燦榮等應用他們實驗室制備的催化信號放大(Catalyzedsignalamplifi2cation,CSA)試劑應用于IHC檢測50例10種不同類型的腫瘤切片中40種不同的抗原和ISH檢測6種不同的RNA成分,并與常規(guī)方法進行敏感性比較:CSA2IHC法較傳統(tǒng)的PAP法、ABC法和LSAB法敏感500～1000倍,較EnVision法敏感20～100倍。參考文獻[1]巴德年當代免疫學技術與應用北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯合出版社,1999.1-11.[2]沈關心,周汝麟現代免疫學實驗技術湖北科學出版社,1998.1-50.[3]黃翔瑞,陳娟,李曉萸等西藏環(huán)狀病毒細胞生物學特性研究軍事醫(yī)學科學院院刊,2000,24(3):173-176.[4]PritchardLI,GouldAR.Phylogeneticcomparisonoftheserotype2specificVP2proteinofbluetongueandrelatedorbiviruses[J].VirusRes,1995,39(2-3):207-210.[5]梁國棟,李其平,何英等我國首次分離到辛德畢斯病毒病毒學報1993,5(1):55-57[6]陳振光,陳娟,黃翔瑞等福建寧化辛德畢斯熱血清學調查中國媒介生物學及控制雜志,2000,11(2):137-139.[7]李月白,秦國斌,王義生等人骨肉瘤中p21waf1/cip1基因的表達中華骨科雜志,2000,20(1):30-33.[8]張雅萍,姬秋和,張南雁等甲狀腺腫瘤組織中IL28的表達及意義第四軍醫(yī)大學學報,2000,21(6):125-128.[9]肖華亮,陳俐,王東MDM2蛋白和P53蛋白在骨肉瘤組織中的表達及意義第三軍醫(yī)大學學報,2000,22(4):357-359.[10]沈巖,VogelIKalthoffH,于吉人,等.不同轉移能力腫瘤細胞間轉移相關特征的比較研究[J].中華腫瘤雜志,2000,22(3):201-204.[11]沈靖南,王晉,韓士英等骨肉瘤p2糖蛋白表達水平與肺轉移中華骨科雜志,2000,20(1):21-23.[12]蔡文琴,王伯倪實用免疫細胞化學與核酸分子雜交技術成都:四川科學技術出版社,1994.1-20.[13]NewmanRA.Bindingofpeanutlectintobreastepithe2lium,humancarcinomaandculturedratmammarystemcells:Useofthelectinasamarberofmammarydifferen2tiation[J].JNatlCancerInst,1979,63:1339-1342.[14]KiverlaTandTarkanenA.Alectincytochemicalstudyofglycoconjugatesin