實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

課題1微生物的利用了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技能目標(biāo)：微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物細(xì)菌的外形與大小圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌細(xì)菌：單細(xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察細(xì)菌的構(gòu)造細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等。圖1-3細(xì)菌的結(jié)構(gòu)*細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：堅(jiān)韌且有彈性細(xì)胞壁有哪些功能？①固定細(xì)胞外形；②保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷；③阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；④使細(xì)胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌.菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。01菌落02細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:分類,舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細(xì)胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）應(yīng)用:單擊此處添加正文，文字是您思想的提煉，為了演示發(fā)布的良好效果，請言簡意賅地闡述您的觀點(diǎn)。鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的氯霉素、紅霉素、慶大霉素病毒的結(jié)構(gòu)2、病毒的增殖：真菌一、基礎(chǔ)知識：（二）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等，半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運(yùn)動，液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途選擇培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:分離雜交瘤細(xì)胞加入青霉素的培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。添加標(biāo)題優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好添加標(biāo)題缺點(diǎn)：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;添加標(biāo)題根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。添加標(biāo)題合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。添加標(biāo)題優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低添加標(biāo)題缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。添加標(biāo)題合成培養(yǎng)基:添加標(biāo)題血清中含有：人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分液體培養(yǎng)基：表面生長01.均勻混濁生長01.沉淀生長01.logo固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔半固體培養(yǎng)基：(是否運(yùn)動)無動力有動力(彌散)不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方(參考教材附錄內(nèi)容)不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽、等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。4.培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基：純化，增菌半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種二、無菌技術(shù)無菌技術(shù)的概念無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別（１）消毒定義：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。區(qū)分為高程度消毒（High-levelDisinfection）、中程度消毒（Intermediate-levelDisinfection）、低程度消毒（Low-levelDisinfection）三種方式。滅菌的定義：以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無菌之過程。

滅菌消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。常用的消毒與滅菌的方法消毒的方法：煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源紫外線消毒……灼燒滅菌干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.滅菌的方法：最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術(shù)logo微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序器具的滅菌培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的滅菌倒平板微生物接種恒溫箱中培養(yǎng)菌種的保存答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。LOGO實(shí)驗(yàn)操作制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）操作步驟計(jì)算、稱量溶化調(diào)pH：pH7．6過濾：這一步可以省去。分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。加塞包扎將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)基用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。8．滅菌:待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。9．倒平板:倒平板技術(shù)問題討論培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？2、純化大腸桿菌平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法logo平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基的原因一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。問題討論為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。問題討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)菌種的保存臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。長期保存：甘油冷凍管藏法四、課題成果評價如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（二）接種操作是否符合無菌要求培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄貳壹叁本課題知識小結(jié):【典例解析】

例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D答案：B單擊此處添加正文，文字是您思想的提煉，為了演示發(fā)布的良好效果，請言簡意賅地闡述您的觀點(diǎn)。您的內(nèi)容已經(jīng)簡明扼要，字字珠璣，但信息卻千絲萬縷、錯綜復(fù)雜，需要用更多的文字來表述；但請您盡可能提煉思想的精髓，否則容易造成觀者的閱讀壓力，適得其反。正如我們都希望改變世界，希望給別人帶去光明，但更多時候我們只需要播下一顆種子，自然有微風(fēng)吹拂，雨露滋養(yǎng)。恰如其分地表達(dá)觀點(diǎn)，往往事半功倍。當(dāng)您的內(nèi)容到達(dá)這個限度時，或許已經(jīng)不純粹作用于演示，極大可能運(yùn)用于閱讀領(lǐng)域；無論是傳播觀點(diǎn)、知識分享還是匯報工作，內(nèi)容的詳盡固然重要，但請一定注意信息框架的清晰，這樣才能使內(nèi)容層次分明，頁面簡潔易讀。如果您的內(nèi)容確實(shí)非常重要又難以精簡，也請使用分段處理，對內(nèi)容進(jìn)行簡單的梳理和提煉，這樣會使邏輯框架相對清晰。例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是單擊此處添加正文，文字是您思想的提煉，為了演示發(fā)布的良好效果，請言簡意賅地闡述您的觀點(diǎn)。您的內(nèi)容已經(jīng)簡明扼要，字字珠璣，但信息卻千絲萬縷、錯綜復(fù)雜，需要用更多的文字來表述；但請您盡可能提煉思想的精髓，否則容易造成觀者的閱讀壓力，適得其反。正如我們都希望改變世界，希望給別人帶去光明，但更多時候我們只需要播下一顆種子，自然有微風(fēng)吹拂，雨露滋養(yǎng)。恰如其分地表達(dá)觀點(diǎn)，往往事半功倍。當(dāng)您的內(nèi)容到達(dá)這個限度時，或許已經(jīng)不純粹作用于演示，極大可能運(yùn)用于閱讀領(lǐng)域；無論是傳播觀點(diǎn)、知識分享還是匯報工作，內(nèi)容的詳盡固然重要，但請一定注意信息框架的清晰，這樣才能使內(nèi)容層次分明，頁面簡潔易讀。如果您的內(nèi)容確實(shí)非常重要又難以精簡，也請使用分段處理，對內(nèi)容進(jìn)行簡單的梳理和提煉，這樣會使邏輯框架相對清晰。A.防止雜菌污染B.消滅雜菌單擊此處添加正文，文字是您思想的提煉，為了演示發(fā)布的良好效果，請言簡意賅地闡述您的觀點(diǎn)。您的內(nèi)容已經(jīng)簡明扼要，字字珠璣，但信息卻千絲萬縷、錯綜復(fù)雜，需要用更多的文字來表述；但請您盡可能提煉思想的精髓，否則容易造成觀者的閱讀壓力，適得其反。正如我們都希望改變世界，希望給別人帶去光明，但更多時候我們只需要播下一顆種子，自然有微風(fēng)吹拂，雨露滋養(yǎng)。恰如其分地表達(dá)觀點(diǎn)，往往事半功倍。當(dāng)您的內(nèi)容到達(dá)這個限度時，或許已經(jīng)不純粹作用于演示，極大可能運(yùn)用于閱讀領(lǐng)域；無論是傳播觀點(diǎn)、知識分享還是匯報工作，內(nèi)容的詳盡固然重要，但請一定注意信息框架的清晰，這樣才能使內(nèi)容層次分明，頁面簡潔易讀。如果您的內(nèi)容確實(shí)非常重要又難以精簡，也請使用分段處理，對內(nèi)容進(jìn)行簡單的梳理和提煉，這樣會使邏輯框架相對清晰。C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必