病理學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)與其應(yīng)用

病理學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)與其應(yīng)用分子病理學(xué)基本概念

現(xiàn)代分子生物學(xué)vs傳統(tǒng)病理學(xué)疾病發(fā)生過(guò)程中分子事件及其與疾病發(fā)生的關(guān)系揭示根本機(jī)制2021/1/52復(fù)習(xí)有關(guān)的分子生物學(xué)概念(1)核酸的結(jié)構(gòu)與功能核酸---多核苷酸。

核酸由核苷酸組成核苷酸由堿基、核糖/脫氧核糖和磷酸構(gòu)成堿基有五種：

A腺嘌呤T胸腺嘧啶U尿嘧啶

G鳥(niǎo)嘌呤C胞嘧啶核苷酸連接方式核酸----DNA（脫氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）2021/1/53DNA和RNA的差別從結(jié)構(gòu)上看DNA：含脫氧核糖及胸腺嘧啶ACGTRNA：含核糖及尿嘧啶ACGU從功能上看DNA：構(gòu)成染色體內(nèi)的基因組、細(xì)胞器基因組，是遺傳信息的貯存和

攜帶者

RNA：包括mRNA(信使RNA),rRNA(核糖體RNA),tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯的功能2021/1/54DNA結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)

即DNA分子中脫氧核苷酸的排列順序堿基順序就代表了核苷酸順序。又稱為核苷酸序列或堿基序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

即DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)這種雙螺旋結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要特征是：在一定條件下，雙鏈可解開(kāi)，亦可重新形成雙鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA超螺旋結(jié)構(gòu)

2021/1/552021/1/56DNA復(fù)制

雙鏈解鏈各自為模板合成新的互補(bǔ)鏈

DNA轉(zhuǎn)錄

以DNA為模板合成RNA過(guò)程

DNA翻譯

蛋白質(zhì)合成的同義詞以遺傳密碼破讀的手段轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的氨基酸排列順序2021/1/57如GGC——甘氨酸GTC——頡氨酸遺傳信息貯存于DNA，在核內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄成mRNA，在胞漿內(nèi)mRNA作直接模板來(lái)指導(dǎo)翻譯(2)基因(gene)基因表達(dá)是指基因的轉(zhuǎn)錄翻譯以及它們的調(diào)控轉(zhuǎn)錄在胞核內(nèi)進(jìn)行，翻譯在胞漿中進(jìn)行(3)染色質(zhì)(chromatin)主要成分是DNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞間期,光鏡下呈細(xì)顆粒狀染色體（chromatosome）

主要成分同上，細(xì)胞分裂期，由染色質(zhì)濃集而成，呈桿狀,有恒定數(shù)目2021/1/58

同一物質(zhì)在不同時(shí)期的形態(tài)變化

(4)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈氨基酸排列順序序列改變→構(gòu)型改變→功能改變二級(jí)結(jié)構(gòu)局部/某一段肽鏈空間位置三級(jí)結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu)）整條肽鏈空間位置四級(jí)結(jié)構(gòu)多條肽鏈位置2021/1/59真核生物基因組單復(fù)制順序（singlecopysequence）在整個(gè)DNA分子中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次中等重復(fù)順序

(moderatelyrepetitivesequences)在DNA分子中重復(fù)出現(xiàn)幾十到幾千次高重復(fù)順序(highlytepetitivesequence)在DNA分子中重復(fù)幾百萬(wàn)次反轉(zhuǎn)重復(fù)順序(invertedrepetitivesequerce)

其特點(diǎn)是一段堿基呈回文結(jié)構(gòu)

回文結(jié)構(gòu)（palindromicstructure）又稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpinstructure)2021/1/510如：5’AAGCTAGCTT3’3’TTCGATCGAA5’其中一條單鏈回折又可形成雙鏈3’TTCGA

∣∣∣∣∣5’AAGCT2021/1/511內(nèi)含子與外顯子內(nèi)含子（intron）或插入順序外顯子（exon）DNA變性定義變性后性質(zhì)變性條件DNA復(fù)性（renaturation）退火2021/1/512影響復(fù)性因素簡(jiǎn)單分子快于復(fù)雜分子

小分子快于大分子

DNA濃度高快于濃度低離子強(qiáng)度高（鹽濃度高）快于離子強(qiáng)度低cDNAmRNA的互補(bǔ)拷貝cDNA缺乏該基因的內(nèi)含子，但含有為產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)所需的全部編碼信息寡核苷酸2021/1/513一.病理學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)(一)核酸分子雜交（nucleicacidmolecularhybridisation）技術(shù)

概念具有一定同源性的核酸單鏈一定條件下堿基互補(bǔ)退火形成雙鏈用帶有標(biāo)記的具有特殊堿基序列（已知堿基序列）的一段DNA或RNA單鏈片段來(lái)檢測(cè)靶核酸（待測(cè)核酸）中是否存在與之同源的序列

已知的核酸序列——即探針（probe）

探針標(biāo)記2021/1/5141.固相雜交(solid-phasehybridization)概念

固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳酸顆粒、磁珠和微孔板等基本方法：在此以膜相為例(1)DNA變性：使DNA由雙鏈解鏈成為單鏈。是成功的關(guān)鍵(2)變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定(3)預(yù)雜交(4)雜交(5)洗膜(6)結(jié)果顯示2021/1/515A.放射性測(cè)定

放射自顯影法液閃記數(shù)法B.非放射性檢測(cè)法AP顯色系統(tǒng)，NBT（四氮唑藍(lán)）顯色分類(1)菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）菌落轉(zhuǎn)到膜上將濾膜上的菌落裂解以釋出DNA(2)斑點(diǎn)雜交（Dotblot）最簡(jiǎn)單有效的膜雜交方法

核酸原液或純化的標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上2021/1/516斑點(diǎn)雜交應(yīng)用于DNA斑點(diǎn)雜交RNA斑點(diǎn)雜交對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，不必提取和純化RNA，只需簡(jiǎn)單處理(0.5%NonidetP40低滲緩沖液)

完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交NaOH處理，使DNA暴露可用于篩選大量標(biāo)本，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針(DNA純度不夠)2021/1/517斑點(diǎn)雜交的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)

A操作簡(jiǎn)便、快速，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電泳分離核酸樣品B可在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)C可作半定量分析缺點(diǎn)A不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子量B特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性(3)印跡雜交（blottinghybridization)southern印跡雜交

（southernblottinghybridization）2021/1/5181975年由Southern創(chuàng)建多用限制性內(nèi)切酶將DNA切成片段進(jìn)行凝膠電泳分離（分開(kāi)）,凝膠上使DNA變性原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移固相支持物上再與相應(yīng)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，確定探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置可用于DNA圖譜分析

基因克隆鑒定（克隆基因的酶切圖譜分析）

基因構(gòu)成研究（基因組的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）等。），2021/1/5192021/1/520northern印跡雜交（Northernblottinghybridization）其被測(cè)樣品是RNA方法與southern印跡雜交類似

此法常用于基因表達(dá)的研究，可推算出癌基因的表達(dá)程度(4)原位雜交（insituhybridization）核酸原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）的簡(jiǎn)稱已知堿基順序并帶有標(biāo)記的核酸作為探針與細(xì)胞組織切片中待測(cè)的核酸特異性結(jié)合成雜交體應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)在被檢測(cè)的核酸原位檢測(cè)雜交信號(hào)2021/1/521首創(chuàng)放射性標(biāo)記(1969)熒光素標(biāo)記(1981)生物素標(biāo)記(1983)

其與菌落原位雜交不同原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在細(xì)胞內(nèi)的空間位置2021/1/522用途

檢測(cè)特定DNA序列在細(xì)胞核或染色體上的特定位置分布

檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNA在細(xì)胞中和組織中的分布及特定基因表達(dá)水平；檢測(cè)細(xì)胞、組織中有無(wú)特異性病原菌、病毒

優(yōu)點(diǎn)：A特異性高，可精確定位,對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性

B能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其它成分的影響

2021/1/523C不需要從組織中提取核酸

D可完整的保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，準(zhǔn)確反映其與組織細(xì)胞的相互關(guān)系原位雜交與免疫組化方法結(jié)合免疫組化

檢測(cè)抗原成分，在翻譯水平上研究基因表達(dá)

原位雜交檢測(cè)DNA/RNA，進(jìn)行基因定位，在基因擴(kuò)增或在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)2021/1/524原位雜交的探針單鏈DNA雙鏈DNARNA探針基本方法(RNA雜交為例)

A.雜交前準(zhǔn)備

固定盡快予以冷凍/固定

培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織、石蠟包埋組織均可進(jìn)行原位雜交通常石蠟包埋信號(hào)低于冰凍切片2021/1/525玻片處理增強(qiáng)組織通透性和探針穿透性稀釋的酸去垢劑（detergent）或清洗劑TritonX100某些消化酶

應(yīng)掌握其用量及孵育時(shí)間

減低背景染色充分洗滌

預(yù)雜交

雜交后低濃度RNA酶處理防止RNA酶污染

B.雜交2021/1/526C.雜交后處理D.顯示

如AP顯色系統(tǒng)NBT（四氮唑藍(lán)）顯色等有兩種方法:

直接法直接標(biāo)記探針

間接法抗原標(biāo)記探針,雜交后,再用特異性標(biāo)記的抗體反應(yīng),在呈色2021/1/5272021/1/5282021/1/5292021/1/530雙重原位雜交方法

通常有兩種方法

A.用相鄰的連續(xù)切片（3μ），用兩種不同的探針進(jìn)行原位雜交

適用于較大細(xì)胞的研究2021/1/531優(yōu)點(diǎn)

二者雜交過(guò)程和結(jié)果互不干擾

顯示方法和呈色可用同一檢測(cè)系統(tǒng)，敏感性相同，可比性強(qiáng)缺點(diǎn)

雜交信號(hào)可能因切片較薄而減弱尋找同一細(xì)胞的切面進(jìn)行分析有一定困難B.用兩種探針在同一標(biāo)本上作原位雜交，兩種不同標(biāo)記探針的雜交陽(yáng)性信號(hào)呈色不同2021/1/532(5)熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技術(shù)基本原理生物素、地高辛或熒光素標(biāo)記特異的DNA探針對(duì)外周血、腫瘤細(xì)胞或癌前組織的離散培養(yǎng)細(xì)胞的染色體鋪片或切片（包括石蠟切片）DNA-DNA原位雜交熒光素標(biāo)記抗探針標(biāo)記物的抗體其雜交定位信號(hào)用熒光法顯示。2021/1/533可用多種熒光素的不同顏色顯示多個(gè)染色體的結(jié)構(gòu)或DNA。如FITC

(fluorescienisothiocy-anate,異硫氰酸熒光素)——呈黃綠色

Texas紅——呈紅色特點(diǎn)

操作簡(jiǎn)易，快捷,探針標(biāo)記后穩(wěn)定方法敏感在同一標(biāo)本上可以同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)不同的基因不僅可以在染色體分裂相上觀察結(jié)果，而且可以應(yīng)用于培養(yǎng)的間期細(xì)胞，組織的石蠟切片、冰凍切片2021/1/5342021/1/535應(yīng)用

臨床應(yīng)用

應(yīng)用非常廣泛研究應(yīng)用

腫瘤中染色體異?；驁D譜繪制確定基因在染色體上的順序(6)其它雜交方法

A.差異雜交（differentialhybridization）B.cDNA微點(diǎn)陣雜交（cDNAmicroarrayhybridization）C.

寡核苷酸微點(diǎn)陣雜交

（oligonucleotidemicroarrayhybridization）

2021/1/5362.液相雜交

（solutionhybridization）所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中(1)吸附雜交方法HAP（羥基磷灰石）吸附雜交方法(DNA:DNA)親和吸附雜交方法(DNA:RNA)生物素標(biāo)記DNA探針?；H和素包被固相支持物用特異性抗DNA-RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng)酶顯色2021/1/537磁珠吸附雜交方法吖啶翁酯（acridiniumester）標(biāo)記探針吸附在磁化的有孔小珠(2)發(fā)光液相方法能量傳遞法兩個(gè)緊接的探針，一個(gè)探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團(tuán)（供體）標(biāo)記，另一個(gè)探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，并且這兩個(gè)探針靠得很近。由于只有在兩個(gè)探針?lè)肿涌康煤芙鼤r(shí)，才能產(chǎn)生發(fā)光具有較好的特異性2021/1/538

吖啶翁酯標(biāo)記法檢測(cè)雜交探針的化學(xué)發(fā)光此法敏感度低僅適用于檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列(3)液相夾心雜交方法親和雜交方法兩個(gè)探針與靶核酸雜交，形成夾心結(jié)構(gòu)。雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上雜交物上的檢測(cè)探針可產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)一般用生物素標(biāo)記吸附探針，用125I標(biāo)記檢測(cè)探針該試驗(yàn)保持了固相雜交的高度特異性2021/1/5392021/1/540(二)聚合酶鏈反應(yīng)及其相關(guān)技術(shù)1.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)又稱體外基因擴(kuò)增利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片段高效擴(kuò)增的技術(shù)獲得或放大特異基因信號(hào)的重要手段基本原理

在模板DNA（待測(cè)DNA）引物（模板兩端的已知序列）四種脫氧核苷酸(dNTP)DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)2021/1/541擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA整個(gè)步驟分三步變性加熱模板DNA成兩條單鏈退火降溫模板DNA與引物互補(bǔ)結(jié)合延伸DNA聚合酶及鎂離子形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈三步為一個(gè)循環(huán)DNA量增加1倍25-30個(gè)循環(huán)DNA可增加106-109倍

2021/1/5422021/1/543PCR反應(yīng)體系組分包括引物DNA聚合酶PCR反應(yīng)緩沖液dNTPs（四種核苷酸）實(shí)際操作中,分別有不同的要求和注意事項(xiàng)反應(yīng)條件應(yīng)不斷優(yōu)化如變性復(fù)性延伸溫度及時(shí)間循環(huán)參數(shù)鎂離子濃度平臺(tái)效應(yīng)防止污染等2021/1/544

PCR模板（待測(cè)DNA）細(xì)菌全血標(biāo)本或白細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋組織

但各自的制備方法各異

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析

凝膠電泳分析瓊脂糖凝膠電泳(最常用)聚丙烯酰胺凝膠電泳單一條帶點(diǎn)雜交方法將產(chǎn)物直接點(diǎn)到膜上2021/1/5452021/1/5462021/1/5472.PCR相關(guān)技術(shù)(1)定量PCR最常用的為競(jìng)爭(zhēng)性PCR

(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

用來(lái)擴(kuò)增RNA的方法

由mRNA逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription,RT）反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA第一條鏈作PCR的模板

2021/1/548(3)競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitivereversttranscription-polymerasechainreaction,c-RT-PCR)(4)多重PCR(multiplexPCR)

(5)反向PCR(inversePCR)對(duì)已知DNA片段兩側(cè)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增(6)不對(duì)稱PCR

(7)錨定PCR

(8)著色互補(bǔ)試驗(yàn)或熒光PCR(9)雙溫PCR(two-temperaturePCR)2021/1/549(10)原位PCR（insituPCR,ISPCR）技術(shù)90年Hasse首次創(chuàng)建概念在細(xì)胞(爬片,甩片,涂片)組織切片(冰凍/石蠟)直接對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法

2021/1/550既能在組織原位檢測(cè)單復(fù)制的特定DNA/RNA又能使擴(kuò)增的特定的DNA/RNA片段在組織切片中定位特點(diǎn)1.PCR特異性高敏感性,又有原位雜交樣的定位準(zhǔn)確性2.能檢測(cè)低于2個(gè)拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定的DNA序列2021/1/5513.有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析基本方法

A.細(xì)胞或組織切片上滴加PCR反應(yīng)液B.把載玻片放入熱循環(huán)儀（原位PCR儀）中進(jìn)行擴(kuò)增C.進(jìn)行原位擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

2021/1/5522021/1/553分類A.直接法原位PCR(directinsituPCR)

基本原理對(duì)三磷酸核苷酸或引物進(jìn)行標(biāo)記使擴(kuò)增產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子據(jù)標(biāo)記物性質(zhì)進(jìn)行產(chǎn)物的檢測(cè)

標(biāo)記物

最常用的有三種

放射性同位素生物素地高辛2021/1/554特點(diǎn)

操作簡(jiǎn)便特異性較差易出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增效率低應(yīng)用注意事項(xiàng)

a.不能用于切片標(biāo)本b.不適用于研究?jī)?nèi)源性基因重排和染色體易位

B．間接原位PCR(indirectinsitu,PCR)基本原理同常規(guī)PCR,不帶任何標(biāo)記物再利用原位雜交方法加以檢測(cè)2021/1/555

主要步驟

標(biāo)本固定保持原有組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

滲入使引物核苷酸和酶等反應(yīng)液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(如用酶進(jìn)行消化)

原位擴(kuò)增通過(guò)原位PCR技術(shù)（原位PCR儀）增加靶核酸序列的數(shù)量，以達(dá)到可檢測(cè)的水平

原位雜交檢測(cè)用特異性探針檢測(cè)產(chǎn)物特點(diǎn)

步驟雖然較多，但擴(kuò)增效率高，特異性較直接法強(qiáng)

2021/1/556在原位PCR中常用的原位雜交標(biāo)記物

非同位素標(biāo)記物如生物素地高辛等C．原位反轉(zhuǎn)錄PCR

(insitureversetranscription,PCR)又稱為insituRT-PCR結(jié)合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（以mRNA為模板合成cDNA）和PCR擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低復(fù)制mRNA的方法

2021/1/557基本原理

它由mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA鏈（即在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以mRNA為模板合成cDNA）

再以cDNA為模板，用PCR對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增結(jié)束后，再用特異性的探針進(jìn)行原位雜交

整個(gè)反應(yīng)過(guò)程均在固定的組織或細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)行

標(biāo)本要用DNA酶處理2021/1/558

原位PCR的應(yīng)用

1)檢測(cè)內(nèi)源性基因

固有基因的檢測(cè)異?；蜃儺惢?/p>

2)外源性基因的檢測(cè)

感染基因病毒基因細(xì)菌基因

導(dǎo)入基因原位PCR應(yīng)用中存在的問(wèn)題及對(duì)策

敏感性特異性2021/1/559產(chǎn)生假陽(yáng)性原因(直接法)錯(cuò)配核苷酸錯(cuò)誤摻入受損DNA修復(fù);擴(kuò)增產(chǎn)物彌散對(duì)策熱啟動(dòng)減少?gòu)浬?fù)雜性定量分析目前還停留在相對(duì)定量或半定量水平(11)免疫聚合酶鏈反應(yīng)（immunopolymerasechainreaction,immuno-PCR,簡(jiǎn)稱免疫PCR）技術(shù)由Sano等于1992年首建2021/1/560基本原理單克隆抗體進(jìn)行生物素化核苷酸（DNA）也生物素化用親和素或鏈霉親和素將兩者連接構(gòu)成具有雙功能的嵌合分子2021/1/561單抗--生物素--中介分子--生物素--DNA

(親和素)與抗原結(jié)合PCR擴(kuò)增抗體端可以與抗原結(jié)合，特異性地捕獲待測(cè)抗原，以保證檢測(cè)結(jié)果的特異性，核酸（DNA）端則可用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，間接證明抗原的存在。產(chǎn)物可用瓊脂糖電泳檢測(cè)采用不同大小標(biāo)準(zhǔn)的DNA進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行電泳檢測(cè)，則可同時(shí)檢出不同的抗原分子。2021/1/562(12)原位免疫PCR（insituimmuno-PCR,IS-PCR）技術(shù)

基本原理中介分子同時(shí)與DNA和抗體分子特異結(jié)合其一端連接DNA（DNA作為標(biāo)記物）另一端連接抗原-抗體復(fù)合物形成一個(gè)抗原-抗體-DNA連接物作為標(biāo)記物的DNA分子用原位PCR擴(kuò)增，檢測(cè)特異的PCR產(chǎn)物，即可間接地證明抗原的存在

中介分子鏈酶親和素（SA）-蛋白A嵌合體2021/1/563(三)用引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記（primedinsitulabelling,PRINS）技術(shù)用于細(xì)胞或染色體原位檢測(cè)特異性DNA/RNA基本原理PCR和FISH技術(shù)的結(jié)合

dUTP（用熒光素如FITC標(biāo)記）和dATPdCTP,dGTP摻入延伸的DNA中，使新合成的DNA帶有熒光素,用熒光顯微鏡檢測(cè)地高辛標(biāo)記再用免疫細(xì)胞化學(xué)顯色普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)2021/1/564特點(diǎn)及應(yīng)用前景

1.快速，簡(jiǎn)便也適用于組織切片2.敏感性和特異性較高.3.具有很高的快速性4.地高辛標(biāo)記，適用于普通顯微鏡觀察，避免了標(biāo)本熒光素標(biāo)記褪色快的缺點(diǎn)5.不需使用DNA或cDNA探針，只需要特異性引物序列，合成簡(jiǎn)便2021/1/565(四)

基因重組技術(shù)基因重組是基因克隆的關(guān)鍵技術(shù)。其基本內(nèi)容包括分離純化或人工合成DNA制備DNA重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞篩選表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞使其擴(kuò)增鑒定目的基因的正確連接及表達(dá)主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝2021/1/566目的基因的獲得通常所需要的目的基因都是一些已有相關(guān)基礎(chǔ)研究的基因

常用方法

1.PCR擴(kuò)增目的基因2.從基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中獲得目的基因3.人工合成目的基因2021/1/567DNA體外重組載體常用的有

質(zhì)粒載體最常用的是pBR322

噬菌體（phage）載體最常用的為λDNA及其衍生物重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞重組體克隆的篩選與鑒定酶切、電泳、雜交等方法2021/1/568(五)

基因轉(zhuǎn)染（genetransfection）技術(shù)將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的技術(shù)方法有磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法電擊基因轉(zhuǎn)染法2021/1/569二.腫瘤研究中常用的分子生物學(xué)技術(shù)

(一)基因擴(kuò)增的檢測(cè)1.原位雜交（ISH）2.熒光原位雜交（FISH）3.Southernblot(DNA雜交)4.Northernblot(RNA雜交)5.原位PCR6.RT_PCR2021/1/570(二)基因突變的檢測(cè)突變的幾種形式點(diǎn)突變基因特定位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的改變基因缺失基因易位或重排其他：插入甲基化染色體非組蛋白改變等2021/1/571突變的檢測(cè)方法1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Singlestrandconformationpolymorphismanalysisofpolymerasechainreactionproducts,PCR-SSCP）

長(zhǎng)度相同，但堿基序列不同的單鏈DNA構(gòu)象不同,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，遷移率（泳動(dòng)率）不同基本方法

作PCR將產(chǎn)物變性而成為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳