DB41T 987-2014 脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

DB41Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberor2014-12-30發(fā)布河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 25.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ 2 3 3 3 3 3 3 3 3附錄A（規(guī)范性附錄）硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 4 6 7 91脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程脫毒組培苗virus-freetissueculSPCSV）和甘薯卷葉病毒（Sweet脫毒種薯（苗）virus-freeseedtuberors用原種作種薯，在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量要求2各級(jí)甘薯種薯（苗）繁殖田中允許出現(xiàn)病毒病癥狀植）；）；4.1組培苗抽樣4.1.1脫毒組培苗4.1.2擴(kuò)繁苗4.2.1原原種田抽樣的面積取樣。每株取上、中、下部葉片1g～5g，-4.2.2原種田和大田用種田抽樣定植后30d、收獲前兩周，在目測(cè)的基礎(chǔ)上，采用五點(diǎn)取樣法。取樣方法及樣品5.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（N用于檢測(cè)SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種病毒，檢5.2指示植物檢測(cè)法用于輔助檢測(cè)SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種3別利用PCR和RT-PCR檢測(cè)。允許帶毒率為0，先目測(cè)調(diào)查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物進(jìn)行檢測(cè)，至少其中5%的樣品分別利用PCR和RT-PCR檢測(cè)。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允許帶毒率≤2.0%，SPCSV和SPLCV的先目測(cè)調(diào)查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物進(jìn)行檢測(cè)，至少其中1%的樣品分別4A.1溶液配制A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]：稱取60.60300mL無菌蒸餾水中，加入32.5），A.1.2氯化鈉溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]：稱取292.20g氯化鈉A.1.3三羥甲基氨基甲烷溶液（TBS分別取1mol/LTris-HCl（A.1.1）2A.1.4洗滌緩沖液（TBST0.5mL吐溫-20（Tween-20）溶于1LTA.1.5抽提緩沖液：稱取亞硫酸鈉（NaA.1.6封閉緩沖液：稱取脫脂奶粉0.50g，分別量取曲拉通（Triton）X-10025mL。先將脫脂奶粉溶于少量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25mL，加入TritonX-100A.1.7抗體緩沖液：稱取脫脂奶粉1.00g，量取TBS（A.1.3）50mL。先將脫脂奶粉溶解于少量TBSA.1.8底物緩沖液：分別稱取三羥甲基氨基甲烷6.10g、氯化鈉2.90g、氯化鎂（MgCl2?6H20.50g，溶于400mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH值至9.5，定容A.1.105-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（BCIP）儲(chǔ)A.1.11NBT/BCIP底物溶液：先后取100μLNBT貯備液（A.1.9）和100μLBCIP貯備液（A.1.10加A.2樣品制備加入3mL抽提緩沖液充分研磨，6000A.3操作步驟A.3.1點(diǎn)膜取15μL上清液滴在膜上方格的正中，室溫干燥15min～30min。同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照。根據(jù)5A.3.2封閉將干燥后的膜浸入封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩1h，轉(zhuǎn)速為50r/A.3.3與一抗反應(yīng)將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的病A.3.4洗膜用洗滌緩沖液洗膜4次，每次搖床振蕩3min，轉(zhuǎn)速A.3.5與二抗反應(yīng)A.3.6洗膜用濾紙將膜表面的溶液吸干，將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，A.3.8終止反應(yīng)棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩10min，轉(zhuǎn)速A.3.9結(jié)果判斷6在防蟲條件下盆栽巴西牽牛（Ipomoeasetosa至1～2片真葉時(shí)嫁接。削成楔型，插入砧木的切口內(nèi)，用封口膜扎緊，置25℃~30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi)，嫁接15d～30d后觀察記），接的巴西牽牛植株均沒有表現(xiàn)任何病毒病癥狀，樣品為陰性；只要有1株表現(xiàn)病毒病癥狀，該樣品判斷7C.1.1TAE電泳緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g、冰乙酸57.1mL、Na2E37.2g，用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.5，滅菌C.1.2溴化乙錠（EB）溶液：稱取溴化乙錠C.1.31.0%瓊脂糖凝膠板：稱取1.00g瓊脂糖加入100mLTAE電泳緩沖液中，在微波爐中加熱至瓊脂糖融化，溫度降至50℃~60℃時(shí)，加溴化乙錠溶液（EB）5μL，搖勻，倒入電泳槽中均勻鋪板，凝固C.1.4CTAB緩沖液：稱取CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）20.00g、NaCl81.80g、EDTA5Tris12.10g，溶于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)pH值至8.0，高溫滅菌后加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮C.1.6加樣緩沖液：稱取EDTA預(yù)熱（60℃)CTAB緩沖液(C.1.4)。取0.5g新鮮植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒入盛有預(yù)熱的600μLCTAB緩沖液(C.1.4)的1.5ml的eppendorf管中，再加入20μL巰基乙醇離心10min；將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積的異丙醇，小心混勻后-20℃放置30min以上，可見DNA絮狀沉淀；10000r/min離心10min，棄去上清液；沉淀加清洗緩沖液（70%乙醇，100mmol/L醋酸銨）漂洗2～3次，10000r/min離心10min，沉淀風(fēng)干后溶于50μLTE緩沖液(C.1.5)。開展后續(xù)PCR反應(yīng)體系為：滅菌重蒸水36.7μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×ExTaqBuffer8制備1.0%瓊脂糖凝膠板（C.1.3）。在電泳槽中加入TAE產(chǎn)物與加樣緩沖液混合后，加入凝膠孔進(jìn)行電泳。恒壓（120V～150V）下電泳應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，如果在2800bp對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣9D.1.1DEPC水：取焦碳酸二乙酯（DEPC)50μL加至100mL滅菌蒸溜水中，室溫放置D.1.2引物溶液：用DEPC水（D.1.1）D.1.3TAE電泳緩沖液、1.0%瓊脂糖凝膠板和溴化乙錠（EB）溶液：TAE電泳溶液和1.0%瓊脂糖凝膠板配制方法分別同附錄C.1.1、C.1.稱取0.1g葉片放于研缽中，加液氮充分研磨成粉，將粉末迅速轉(zhuǎn)入到無RNase的無菌1.5mL離心管倒置于滅菌濾紙上，自然干燥；加入25-200μLDEPC水（D.1.1）溶解沉淀反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：dNTPs（10mmol/L）1μL，MgCl2（25mmol/L）1μL，5×AMV緩沖液2μL， 5μL，上游引物CSV70P1（10μmol/L）和下游引物CSV70P2（10μmol/L）各1μL，制備1.0%