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DB41Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberor2014-12-30發(fā)布河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 25.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定( 2 3 3 3 3 3 3 3 3附錄A(規(guī)范性附錄)硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測 4 6 7 91脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測技術(shù)規(guī)程脫毒組培苗virus-freetissueculSPCSV)和甘薯卷葉病毒(Sweet脫毒種薯(苗)virus-freeseedtuberors用原種作種薯,在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量要求2各級甘薯種薯(苗)繁殖田中允許出現(xiàn)病毒病癥狀植););4.1組培苗抽樣4.1.1脫毒組培苗4.1.2擴(kuò)繁苗4.2.1原原種田抽樣的面積取樣。每株取上、中、下部葉片1g~5g,-4.2.2原種田和大田用種田抽樣定植后30d、收獲前兩周,在目測的基礎(chǔ)上,采用五點(diǎn)取樣法。取樣方法及樣品5.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定(N用于檢測SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種病毒,檢5.2指示植物檢測法用于輔助檢測SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種3別利用PCR和RT-PCR檢測。允許帶毒率為0,先目測調(diào)查樣品的病毒顯癥率,然后利用NCM-ELISA或指示植物進(jìn)行檢測,至少其中5%的樣品分別利用PCR和RT-PCR檢測。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允許帶毒率≤2.0%,SPCSV和SPLCV的先目測調(diào)查樣品的病毒顯癥率,然后利用NCM-ELISA或指示植物進(jìn)行檢測,至少其中1%的樣品分別4A.1溶液配制A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]:稱取60.60300mL無菌蒸餾水中,加入32.5),A.1.2氯化鈉溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]:稱取292.20g氯化鈉A.1.3三羥甲基氨基甲烷溶液(TBS分別取1mol/LTris-HCl(A.1.1)2A.1.4洗滌緩沖液(TBST0.5mL吐溫-20(Tween-20)溶于1LTA.1.5抽提緩沖液:稱取亞硫酸鈉(NaA.1.6封閉緩沖液:稱取脫脂奶粉0.50g,分別量取曲拉通(Triton)X-10025mL。先將脫脂奶粉溶于少量TBS(A.1.3)中,再用TBS(A.1.3)定容至25mL,加入TritonX-100A.1.7抗體緩沖液:稱取脫脂奶粉1.00g,量取TBS(A.1.3)50mL。先將脫脂奶粉溶解于少量TBSA.1.8底物緩沖液:分別稱取三羥甲基氨基甲烷6.10g、氯化鈉2.90g、氯化鎂(MgCl2?6H20.50g,溶于400mL蒸餾水中,用濃鹽酸調(diào)pH值至9.5,定容A.1.105-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)儲A.1.11NBT/BCIP底物溶液:先后取100μLNBT貯備液(A.1.9)和100μLBCIP貯備液(A.1.10加A.2樣品制備加入3mL抽提緩沖液充分研磨,6000A.3操作步驟A.3.1點(diǎn)膜取15μL上清液滴在膜上方格的正中,室溫干燥15min~30min。同時設(shè)陽性、陰性和空白對照。根據(jù)5A.3.2封閉將干燥后的膜浸入封閉緩沖液中,室溫下?lián)u床振蕩1h,轉(zhuǎn)速為50r/A.3.3與一抗反應(yīng)將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的病A.3.4洗膜用洗滌緩沖液洗膜4次,每次搖床振蕩3min,轉(zhuǎn)速A.3.5與二抗反應(yīng)A.3.6洗膜用濾紙將膜表面的溶液吸干,將膜置于NBT/BCIP底物溶液中,A.3.8終止反應(yīng)棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次,每次搖床振蕩10min,轉(zhuǎn)速A.3.9結(jié)果判斷6在防蟲條件下盆栽巴西牽牛(Ipomoeasetosa至1~2片真葉時嫁接。削成楔型,插入砧木的切口內(nèi),用封口膜扎緊,置25℃~30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi),嫁接15d~30d后觀察記),接的巴西牽牛植株均沒有表現(xiàn)任何病毒病癥狀,樣品為陰性;只要有1株表現(xiàn)病毒病癥狀,該樣品判斷7C.1.1TAE電泳緩沖液:稱取三羥基甲基氨基甲烷(Tris)242.0g、冰乙酸57.1mL、Na2E37.2g,用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.5,滅菌C.1.2溴化乙錠(EB)溶液:稱取溴化乙錠C.1.31.0%瓊脂糖凝膠板:稱取1.00g瓊脂糖加入100mLTAE電泳緩沖液中,在微波爐中加熱至瓊脂糖融化,溫度降至50℃~60℃時,加溴化乙錠溶液(EB)5μL,搖勻,倒入電泳槽中均勻鋪板,凝固C.1.4CTAB緩沖液:稱取CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)20.00g、NaCl81.80g、EDTA5Tris12.10g,溶于1L蒸餾水中,用HCl調(diào)pH值至8.0,高溫滅菌后加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮C.1.6加樣緩沖液:稱取EDTA預(yù)熱(60℃)CTAB緩沖液(C.1.4)。取0.5g新鮮植物材料,于液氮中研磨成粉,把粉末倒入盛有預(yù)熱的600μLCTAB緩沖液(C.1.4)的1.5ml的eppendorf管中,再加入20μL巰基乙醇離心10min;將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中,加入2/3體積的異丙醇,小心混勻后-20℃放置30min以上,可見DNA絮狀沉淀;10000r/min離心10min,棄去上清液;沉淀加清洗緩沖液(70%乙醇,100mmol/L醋酸銨)漂洗2~3次,10000r/min離心10min,沉淀風(fēng)干后溶于50μLTE緩沖液(C.1.5)。開展后續(xù)PCR反應(yīng)體系為:滅菌重蒸水36.7μL,dNTPs(2.5mmol/L)4μL,10×ExTaqBuffer8制備1.0%瓊脂糖凝膠板(C.1.3)。在電泳槽中加入TAE產(chǎn)物與加樣緩沖液混合后,加入凝膠孔進(jìn)行電泳。恒壓(120V~150V)下電泳應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法對待檢樣品進(jìn)行檢測,如果在2800bp對應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶,則判定樣9D.1.1DEPC水:取焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL加至100mL滅菌蒸溜水中,室溫放置D.1.2引物溶液:用DEPC水(D.1.1)D.1.3TAE電泳緩沖液、1.0%瓊脂糖凝膠板和溴化乙錠(EB)溶液:TAE電泳溶液和1.0%瓊脂糖凝膠板配制方法分別同附錄C.1.1、C.1.稱取0.1g葉片放于研缽中,加液氮充分研磨成粉,將粉末迅速轉(zhuǎn)入到無RNase的無菌1.5mL離心管倒置于滅菌濾紙上,自然干燥;加入25-200μLDEPC水(D.1.1)溶解沉淀反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為:dNTPs(10mmol/L)1μL,MgCl2(25mmol/L)1μL,5×AMV緩沖液2μL, 5μL,上游引物CSV70P1(10μmol/L)和下游引物CSV70P2(10μmol/L)各1μL,制備1.0%
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