微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 18項(xiàng)目十八：細(xì)菌其它鑒定技術(shù)

項(xiàng)目十八細(xì)菌其他鑒定技術(shù)學(xué)習(xí)目標(biāo)1．掌握常用藥敏試驗(yàn)的鑒定范圍。2．熟悉免疫學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定的適用范圍。3．了解免疫學(xué)鑒定、藥敏鑒定及分子生物學(xué)等其他鑒定技術(shù)的方法。4．具有正確利用其他鑒定技術(shù)鑒定細(xì)菌的能力。5．能應(yīng)用相關(guān)鑒定技術(shù)鑒定細(xì)菌。思維導(dǎo)圖一、免疫學(xué)鑒定一、免疫學(xué)鑒定免疫學(xué)反應(yīng)：指相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，所出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。免疫學(xué)反應(yīng)的種類(lèi)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、中和反應(yīng)4、標(biāo)記技術(shù)抗血清生理鹽水待檢菌凝集者為+未凝集顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱(chēng)為凝集反應(yīng)凝集試驗(yàn)（3）診斷血清及類(lèi)型診斷血清：將已知的抗原注射于動(dòng)物體，使其產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，采出動(dòng)物的血液，分離出含有大量抗體的血清，稱(chēng)為診斷血清（或抗血清、免疫血清）抗O血清：用菌體抗原（O抗原）免疫動(dòng)物后所獲得的血清?？笻血清：用鞭毛抗原（H抗原）免疫動(dòng)物后所獲得的血清。表面抗原血清：用含有表面抗原的菌體免疫動(dòng)物后所獲得的血清。多價(jià)診斷血清：用含有兩種（型）的菌體免疫動(dòng)物后所獲得的血清。單價(jià)診斷血清：只含有一種（型）特異性抗體的血清。因子診斷血清：把含有多種抗體的混合免疫血清，用具有共同抗原成分的有關(guān)細(xì)菌將其共同抗體吸收，只留下一種或幾種所需的特異性抗體的血清。二、藥敏鑒定實(shí)驗(yàn)二、細(xì)菌鑒定的藥物敏感試驗(yàn)原理：A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全敏感，而其他鏈球菌則耐藥。培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏0.04U/片結(jié)果：＞10mm敏感；＜10mm耐藥意義：A群鏈球菌敏感1.桿菌肽試驗(yàn)2.O/129試驗(yàn)原理：O/129（二氨基喋啶）對(duì)弧菌屬有抑制作用，而對(duì)氣單胞菌屬無(wú)抑制作用培養(yǎng)基；堿性瓊脂培養(yǎng)基方法：紙片法藥敏40ug/片結(jié)果：有抑菌環(huán)為敏感，無(wú)抑菌環(huán)為耐藥意義：弧菌、鄰單胞菌敏感；氣單胞菌屬耐藥3.奧普托欣(Optochin)試驗(yàn)原理：肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感，其他鏈球菌無(wú)抑制作用培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑＞14mm敏感；＜14mm耐藥，此時(shí)加做膽汁溶菌試驗(yàn)證實(shí)意義：肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感三、分子生物學(xué)檢測(cè)三、分子生物學(xué)檢測(cè)（一）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱(chēng)為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。

PCR技術(shù)的原理1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱(chēng)之為變性。2.退火：是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸以堿基配對(duì)形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長(zhǎng)度的鏈不同長(zhǎng)度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長(zhǎng)度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。

定義

兩條來(lái)源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體，這個(gè)過(guò)程即雜交，或稱(chēng)分子雜交。分類(lèi)

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA（二）核酸雜交(Hybridization)（三）生物芯片技術(shù)生物芯片（biochip）的概念指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子雜交，通過(guò)特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。根據(jù)生物分子之間特異性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗體、受體-配體之間可發(fā)生的復(fù)性與特異性結(jié)合，設(shè)計(jì)一方為探針，并固定在微小的載體表面，通過(guò)分子之間的特性性反應(yīng)，檢測(cè)另外一方有無(wú)、多少或者結(jié)構(gòu)改變等。生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點(diǎn)陣(microarray）。生物芯片的主要特點(diǎn)：高通量、微型化和自動(dòng)化常用的生物芯片的分類(lèi)：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片