微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 25項(xiàng)目二十五：分枝桿菌鑒定

項(xiàng)目二十五分枝桿菌鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)1．掌握結(jié)核分枝桿菌的主要生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。2．熟悉麻風(fēng)桿菌主要生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。3．具有正確采集和處理常見結(jié)核分枝桿菌感染后檢驗(yàn)標(biāo)本及進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)的能力。4．能對(duì)結(jié)核分枝桿菌各種檢驗(yàn)結(jié)果的正確判斷和分析試驗(yàn)結(jié)果并發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。項(xiàng)目二十五分枝桿菌鑒定項(xiàng)目二十五分枝桿菌鑒定思維導(dǎo)圖一、分枝桿菌屬的概述項(xiàng)目二十五分枝桿菌鑒定一、分枝桿菌屬的概述概述1.分枝桿菌屬（Mycobacterium）為一類細(xì)長(zhǎng)或略彎曲、有時(shí)呈分枝狀的桿菌。是分枝桿菌科內(nèi)唯一菌屬，DNAG+Cmol%為62~70，種類很多，有結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌及其他分枝桿菌。2.分枝桿菌屬專性需氧，主要特點(diǎn)是細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，可占其干重的60%，一般不易著色，需要用抗酸染色法進(jìn)行染色，染色后呈紅色。3.分枝桿菌屬無莢膜，無芽胞，不產(chǎn)生外毒素、內(nèi)毒素及侵襲性酶，其致病主要與菌體成分有關(guān)，引起的疾病呈慢性。二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定項(xiàng)目二十五分枝桿菌鑒定1.生物學(xué)性狀（1）形態(tài)與染色：菌體細(xì)長(zhǎng)或略微彎曲，無莢膜，無鞭毛，無芽胞，革蘭陽性，但不易著色，一般用齊-尼抗酸染色法染色，菌體呈紅色。二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌1.生物學(xué)性狀（2）培養(yǎng)特性：專性需氧，營(yíng)養(yǎng)要求高，需在含有血清、蛋黃、甘油、馬鈴薯等培養(yǎng)基（如羅氏培養(yǎng)基）上才能生長(zhǎng)35℃~40℃均可生長(zhǎng)，最適PH值6.5~6.8，生長(zhǎng)緩慢，需要2~4周才能長(zhǎng)出菌落，菌落呈干燥顆粒狀，不透明，米白色或米黃色，表面粗糙，似菜花。二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌1.生物學(xué)性狀（3）生化反應(yīng)：該菌不發(fā)酵糖類，能產(chǎn)生觸酶，而耐熱觸酶試驗(yàn)大多為陰性，非結(jié)核分枝桿菌則大多為耐熱觸酶試驗(yàn)陽性。人型結(jié)核分枝桿菌煙酸試驗(yàn)，硝酸鹽還原和煙酸試驗(yàn)均為陽性，可借此與牛型結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒別二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌1.生物學(xué)性狀（4）抵抗力

三耐：耐干燥---細(xì)胞壁的脂質(zhì)可防止菌體內(nèi)水分丟失在干燥痰中可存活數(shù)月耐酸或堿----對(duì)3%鹽酸或6%硫酸及4%慶陽環(huán)有抵抗力耐染料-----對(duì)結(jié)晶紫（1：75000）和孔雀綠（1：13000）有抵抗力三敏感：對(duì)乙醇敏感對(duì)濕熱敏感（62℃~63℃，15min或煮沸即可殺死）對(duì)紫外線敏感

二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌1.生物學(xué)性狀（5）變異性

1）形態(tài)變異

2）菌落變異

3）毒力變異-----卡介苗（BCG）

4）免疫原性變異

5）耐藥性變異二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌2.臨床意義（1）主要致病物質(zhì)：

結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，其致病性與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起炎癥，菌體成分及代謝產(chǎn)物以及機(jī)體對(duì)菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。

1）脂質(zhì)：脂質(zhì)含量與毒力關(guān)系密切

2）蛋白質(zhì)

3）多糖二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌2.臨床意義（2）所致疾?。涸摼ㄟ^呼吸道、消化道和受損皮膚進(jìn)入機(jī)體引起結(jié)結(jié)核病。其中肺結(jié)核最多見。（3）免疫學(xué)與超敏反應(yīng)

1）免疫性結(jié)核桿菌是胞內(nèi)感染，免疫是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫，接合的免疫屬于帶菌免疫。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，也可產(chǎn)生多種抗體，但這些抗體對(duì)機(jī)體無保護(hù)作用。

2）超敏反應(yīng)機(jī)體在抗結(jié)核免疫的同時(shí)，也形成了對(duì)結(jié)核分枝桿菌的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

3）結(jié)核菌素試驗(yàn)二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌1、原理：用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，來檢測(cè)受試者對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否具有免疫功能及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的一種試驗(yàn)。2、方法：用舊結(jié)核菌素（OT）5U或結(jié)核菌素衍生物PPD5U注射于前臂屈側(cè)皮內(nèi)，48~72小時(shí)后觀察結(jié)果。3、結(jié)果：觀察注射部位是否出現(xiàn)紅腫或硬結(jié)無紅腫或硬結(jié)<5mm為陰性，表示受試者無免疫力紅腫或硬結(jié)≥5mm，為陽性，表示受試者有免疫力紅腫或硬結(jié)≥15mm，為強(qiáng)陽性，提示受試者有結(jié)核分枝桿菌感染4、臨床意義：1）卡介苗接種效果判斷；2）作為嬰幼兒結(jié)核病的輔助診斷；

3）測(cè)定腫瘤患者等細(xì)胞免疫功能二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定附：結(jié)核菌素試驗(yàn)3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）標(biāo)本采集：根據(jù)感染部位的不同，可采取不同的標(biāo)本，結(jié)核病患者各感染部位的標(biāo)本中大多混有其他雜菌，為此采取能抑制污染菌的方法，若需分離培養(yǎng)，必須使用滅菌容器，患者應(yīng)停藥1~2天后再在即標(biāo)本。二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定（一）銅綠假單胞菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（2）檢驗(yàn)程序二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（3）檢驗(yàn)方法1）直接鏡檢：①直接涂片：涂片、抗酸染色(薄涂片+厚涂片）

②集菌涂片③熒光顯微鏡檢查法：金胺“O”染色二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定附：結(jié)核分枝桿菌鏡檢報(bào)告方式染色方法報(bào)告方式鏡檢結(jié)果抗酸染色法（×1000）

—仔細(xì)觀察至少300視野未發(fā)現(xiàn)抗酸菌±300個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1~2條抗酸菌（全部涂膜鏡檢3遍）＋100個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1~9條抗酸菌（全部涂膜鏡檢1遍）2＋10個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1~9條抗酸菌3＋每個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1~9條抗酸菌4＋每個(gè)視野發(fā)現(xiàn)9條以上抗酸菌熒光染色法（×400）—仔細(xì)觀察至少300視野未發(fā)現(xiàn)抗酸菌±70個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1~2條抗酸菌（全部涂膜鏡檢1~2遍）＋50個(gè)視野發(fā)現(xiàn)1~2條抗酸菌（全部涂膜鏡檢1遍）2＋10個(gè)視野發(fā)現(xiàn)4~36條抗酸菌3＋每個(gè)視野發(fā)現(xiàn)4~36條抗酸菌4＋每個(gè)視野發(fā)現(xiàn)36條以上抗酸菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（3）檢驗(yàn)方法2）分離培養(yǎng)：

①標(biāo)本處理：因標(biāo)本雜菌多，需進(jìn)行接種前處理，一般用4%氫氧化鈉、

4%硫酸或胰酶-苯扎溴銨處理標(biāo)本。

②培養(yǎng)基選擇：

培養(yǎng)基種類多，一般固體分離培養(yǎng)選擇羅氏培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)選擇米德爾布魯克7H9培養(yǎng)基

③培養(yǎng)：37℃培養(yǎng)，一周內(nèi)每天觀察一次，一周后每周觀察一次，直至6~8周。二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定附：結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果記錄與報(bào)告方法報(bào)告方式

培養(yǎng)結(jié)果+

斜面上生長(zhǎng)20個(gè)菌落以上，占斜面1/4以下2+

斜面上菌落生長(zhǎng)面積占斜面1/4以上，1/2以下3+

斜面上菌落生長(zhǎng)面積占斜面1/2以上4+

斜面上菌落生長(zhǎng)密集成菌苔4.防治原則國際衛(wèi)生組織提出控制結(jié)核病的方法有1）發(fā)現(xiàn)及治療痰菌陽性的患者2）新生兒接種卡介苗二、結(jié)核分枝桿菌的鑒定結(jié)核分枝桿菌簡(jiǎn)稱麻風(fēng)桿菌，是麻風(fēng)的病原菌。1.生物學(xué)性狀麻風(fēng)桿菌菌體比結(jié)核分枝桿菌短而粗，抗酸染色呈紅色，常成束或成團(tuán)排列，屬于胞內(nèi)寄生菌，被麻風(fēng)桿菌感染的細(xì)胞呈泡沫狀，稱為麻風(fēng)細(xì)胞（有診斷意義）。麻風(fēng)桿菌體外人工培養(yǎng)未獲成功。三、麻風(fēng)分枝桿菌的鑒定麻風(fēng)分枝桿菌2.臨床意義

人是麻風(fēng)桿菌的唯一宿主，也是唯一傳染源，人因接觸而引起感染，麻風(fēng)病可分為兩類：結(jié)核樣型和瘤型。結(jié)核樣型麻風(fēng)多見，傳染性?。涣鲂吐轱L(fēng)少見，傳染性強(qiáng)。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)

涂片檢查是目前最主要的診斷方法。從病變部位采集樣本，經(jīng)抗酸染色后鏡檢。金胺染色可提高陽性檢出率。三、麻風(fēng)分枝桿菌的鑒定麻風(fēng)分枝桿菌四、非典型