第5章-分子生物學(xué)技術(shù)-上

第五章分子生物學(xué)研究法

第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理第二節(jié)PCR技術(shù)第三節(jié)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)第四節(jié)基因文庫構(gòu)建第五節(jié)RACE技術(shù)第六節(jié)酵母雙雜交技術(shù)基因工程中常見的名詞：遺傳工程--geneticengineering；基因操作--gonemanipulation；基因克隆--gonecloning；分子克隆--molecularcloning；重組DNA技術(shù)--recombinantDNAtechnology。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理基因工程的主要內(nèi)容或步驟:

1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。

2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。

3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理基因工程的主要內(nèi)容或步驟:

4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。

5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理DNA重組技術(shù)DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體PvuⅡDNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體DNA重組操作過程示意圖第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理3.細(xì)菌的轉(zhuǎn)化

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2

處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用Apr符號(hào)表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。

乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖。乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。

LacZ基因編碼的乳糖苷酶

X-gal藍(lán)色吲哚產(chǎn)物(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)

藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal

試驗(yàn)）標(biāo)志補(bǔ)救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H

片段COOH

片段lacZX-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶λ噬菌體作為

克隆載體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖5.基因擴(kuò)增PCR技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)故事發(fā)生在1983年

的春夏之交KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎(jiǎng)，Mullis是其中之一Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA，……Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)

1983年9月中旬。

Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37

℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖PCR的發(fā)展史1983年春，Mullis發(fā)展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)，只用一個(gè)循環(huán)；1983年12月，用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49bp長(zhǎng)度的第一個(gè)PCR片斷；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術(shù)，導(dǎo)致Mullis的文章到處被拒；1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202

），這回Mullis是第一發(fā)明人。1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法；1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，這是85年春天Mullis建議做的；1988年，第一臺(tái)PCR儀問世；1991年，HoffmanLaRoche以3億美元的代價(jià)從Cetus公司獲得全權(quán)開發(fā)權(quán)。PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多D