基因工程與分子生物學(xué)常用技術(shù)課件

關(guān)于基因工程與分子生物學(xué)常用技術(shù)第一頁(yè)，本課件共有34頁(yè)第一節(jié)基因工程與基因重組

(GeneticEngineeringandGeneticrecombination)

一、基因工程的基本概念

不同來(lái)源的DNA分子可以通過(guò)磷酸二酯鍵連接形成重新組合的DNA分子，稱(chēng)為DNA重組。

將基因進(jìn)行克隆，并表達(dá)制備特定的產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱(chēng)為基因工程。第二頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(一)工具酶1.限制性核酸內(nèi)切酶

(1)能夠切割DNA中磷酸二酯鍵的酶稱(chēng)核酸酶，其中有選擇地切割DNA分子特異序列的核酸酶，稱(chēng)為限制性核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱(chēng)限制性?xún)?nèi)切酶。(2)命名HindⅢ

屬

系

株

序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶(3)識(shí)別特征5′???GAATTC???3′3′???CTTAAG???5′

限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征。第三頁(yè)，本課件共有34頁(yè)

不同的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別和切割的特異性不同，結(jié)果有3種不同的情況：①產(chǎn)生3′突出粘性末端：以EcoRⅠ為例：5′???G↓AATTC???3′5′???GAATTC???3′3′???CTTAA↑G???5′3′???CTTAAG???5′

②產(chǎn)生5′突出粘性末端：以PstⅠ為例：5′???CTGCA↓G???3′5′???CTGCAG???3′3′???G↑ACGTC???5′3′???GACGTC???5′

③產(chǎn)生平末端：NruⅠ為例：5′???TCG↓CGA???3′5′???TCGCGA???3′3′???AGC↑GCT???5′3′???AGCGCT???5′(4)切割位點(diǎn)第四頁(yè)，本課件共有34頁(yè)2.DNA聚合酶(1)基因工程主要應(yīng)用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。(2)主要用途：①利用5/→3/聚合活性，合成DNA第二條鏈；②對(duì)DNA的3/端進(jìn)行填補(bǔ)或末端標(biāo)記；③E.coliDNA-polⅠ用于缺口平移，制作探針；④T4DNA聚合酶可用于DNA序列測(cè)定；⑤TaqDNA聚合酶用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。3.DNA連接酶

使單鏈切口形成磷酸二酯鍵，共價(jià)地連接。第五頁(yè)，本課件共有34頁(yè)4.逆轉(zhuǎn)錄酶(1)用于真核mRNA逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。(2)用于進(jìn)行3/端填補(bǔ)和標(biāo)記，制備DNA探針。(3)用于DNA序列測(cè)定。

5.多核苷酸激酶

(1)用于放射性標(biāo)記DNA鏈的5/端。

(2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。6.堿性磷酸酶此酶防止載體的自身連接。7.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化單核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA的3/-端羥基上。第六頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(二)載體1.為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，稱(chēng)為載體。2.載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制。易進(jìn)入宿主細(xì)胞。具有多克隆位點(diǎn)。易從宿主細(xì)胞中分離純化。有易被識(shí)別和篩選的標(biāo)志。質(zhì)粒噬菌體粘粒病毒3.常用載體第七頁(yè)，本課件共有34頁(yè)①質(zhì)粒是細(xì)菌中獨(dú)立于染色質(zhì)以外的、能自主復(fù)制的、并與細(xì)菌或細(xì)胞共存的遺傳成分，可賦予宿主細(xì)胞某些遺傳性狀。②通常質(zhì)粒的大小為2～300kb。③一般只能容納10kb的外源DNA片斷。(1)質(zhì)粒(plasmid)第八頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(2)噬菌體(bacteriophage，phage)①噬菌體是感染細(xì)菌的一類(lèi)病毒，因其寄生在細(xì)菌中并能溶解細(xì)菌細(xì)胞，故稱(chēng)為噬菌體。

②噬菌體由頭和尾構(gòu)成，感染時(shí)尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。③具有溶菌性和溶原性?xún)煞N不同的繁殖方式。

第九頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(3)粘粒(cosmid)②粘粒本身約4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因組文庫(kù)的載體。①粘粒是將λ噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒組合的裝配型載體。(4)病毒

病毒載體更多地用于真核表達(dá)系統(tǒng)，如腺病毒、痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和猴空泡病毒。第十頁(yè)，本課件共有34頁(yè)二、重組DNA技術(shù)的基本原理和過(guò)程

基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖后所形成的子代群體。進(jìn)行分子克隆所采用的技術(shù)即重組DNA技術(shù)，故又稱(chēng)為分子克隆技術(shù)或基因工程技術(shù)。

制備目的基因和相關(guān)載體；將目的基因和載體進(jìn)行連接；將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；

DNA重組體的篩選和鑒定；

DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)。

基本步驟第十一頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(一)目的基因的制備1.制備基因組DNA文庫(kù)

(genomiclibrary)

將基因組DNA酶切成片段，再與載體分子拼接成重組DNA，將其引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，所得分子克隆混合體稱(chēng)基因組文庫(kù)。2.制備cDNA文庫(kù)

(cDNAlibrary)

將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再與載體連接成重組DNA，將其引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，所得分子克隆的混合體稱(chēng)為cDNA文庫(kù)。第十二頁(yè)，本課件共有34頁(yè)3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

如已知目的基因序列，則可采用PCR從基因組DNA中獲得目的基因，也可以采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)直接從mRNA獲得特定基因的cDNA。4．化學(xué)合成

如已知肽鏈的氨基酸順序，則可按對(duì)應(yīng)密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列，然后合成該段DNA序列。第十三頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(二)目的基因與載體的連接1．粘性末端連接2．同聚物加尾連接3．平末端連接4．人工接頭連接

將目的基因插入載體，用DNA連接酶連接雙鏈DNA粘性末端序列，在體外重新連接成人工重組體。方法主要有以下四種：第十四頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(三)將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞常用的方法有以下兩種：1.轉(zhuǎn)化(transformation)

轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或其他外源DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過(guò)程。2.感染(infection)

感染是指以噬菌體進(jìn)入宿主菌或病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖的過(guò)程。第十五頁(yè)，本課件共有34頁(yè)1.遺傳學(xué)方法針對(duì)載體攜帶有某些標(biāo)志基因如抗藥性標(biāo)志基因(ampr、tetr、kanr等)和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。2.分子雜交方法

利用32P標(biāo)記的探針與重組DNA或克隆DNA片段進(jìn)行分子雜交，直接篩選并鑒定目的基因。3.免疫學(xué)方法利用特異性抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異結(jié)合的方法篩選。(四)目的基因的篩選和鑒定第十六頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(五)克隆基因的表達(dá)

利用重組DNA技術(shù)所獲得目的基因或DNA序列，可實(shí)現(xiàn)在受體細(xì)胞中的表達(dá)，即產(chǎn)生mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。(六)重組DNA技術(shù)操作過(guò)程總結(jié)歸納

分切接轉(zhuǎn)篩分離目的基因限制酶切目的基因與載體拼接重組體轉(zhuǎn)入受體菌篩選重組體第十七頁(yè)，本課件共有34頁(yè)2.特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適應(yīng)性強(qiáng)。三、基因診斷和基因治療1.基因診斷是指利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。(一)基因診斷(genediagnosis)

3.應(yīng)用遺傳性疾病腫瘤感染性疾病遺傳易感性疾病器官移植配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定第十八頁(yè)，本課件共有34頁(yè)1.基因治療是指以正?；虺C正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細(xì)胞中缺陷基因表達(dá)的一種治療疾病的方法。2.

狹義的基因治療是指將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，與宿主細(xì)胞的基因整合后表達(dá)以達(dá)到治療疾病的方法。3.

廣義的基因治療是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用以達(dá)到治療疾病的方法。

(二)基因治療(genetherapy)第十九頁(yè)，本課件共有34頁(yè)5.基因治療的基本程序(1)選擇和制備目的基因：治療性基因。(2)選擇基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體：通常選擇病毒載體。(3)選擇靶細(xì)胞：體細(xì)胞、生殖細(xì)胞。(4)轉(zhuǎn)移基因：將治療基因?qū)氩⒈磉_(dá)。4.基因治療的基本策略基因增補(bǔ)基因置換基因矯正基因失活基因疫苗第二十頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(TheTechnologyandApplicationinMolecularBiology)第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用

核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)是指利用DNA復(fù)性原理，把不同來(lái)源的DNA單鏈或DNA與RNA混合，如單鏈分子間有堿基配對(duì)關(guān)系，則可形成雜化雙鏈的過(guò)程。一、核酸分子雜交技術(shù)第二十一頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(一)探針(probe)2.理想探針的特點(diǎn)

(1)帶有標(biāo)記的示蹤物，便于檢測(cè)、鑒定；

(2)應(yīng)是單鏈；

(3)具有高度特異性；

(4)探針長(zhǎng)度一般為數(shù)十至數(shù)千個(gè)堿基;(5)具有高靈敏度和穩(wěn)定性，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便安全。1.

探針是一段與被測(cè)的核苷酸序列(靶基因序列)互補(bǔ)的帶有標(biāo)記的核苷酸片段。第二十二頁(yè)，本課件共有34頁(yè)(二)核酸分子雜交的基本方法Southern印跡雜交

(1)指將經(jīng)酶切和電泳分離的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上，然后與標(biāo)記的DNA探針雜交。

(2)可用于分子克隆、遺傳病診斷、法醫(yī)鑒定、腫瘤研究和器官移植等方面。2.Northern印跡雜交

(1)指將經(jīng)電泳分離后的待測(cè)RNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。

(2)主要用于檢測(cè)各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，主要是mRNA。第二十三頁(yè)，本課件共有34頁(yè)第二十四頁(yè)，本課件共有34頁(yè)3.斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交

(1)指將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再與探針雜交，稱(chēng)為斑點(diǎn)印跡。若采用狹縫點(diǎn)樣器加樣后雜交，其印跡為線狀，稱(chēng)為狹縫印跡雜交。

(2)主要用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究。4.原位雜交

(1)指將標(biāo)記的核酸探針與經(jīng)適當(dāng)方法處理的細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)為原位雜交。

(2)該方法不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，有很高的靈敏度，并可保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。第二十五頁(yè)，本課件共有34頁(yè)二、聚合酶鏈反應(yīng)(一)PCR的基本原理1.PCR有三個(gè)反應(yīng)步驟DNA的變性DNA與引物的退火(復(fù)性)引物的延伸。第二十六頁(yè)，本課件共有34頁(yè)n個(gè)循環(huán)加熱變性模板DNA退火DNA延伸P25′

3′5′

3′5′

3′

3′P15′2.變性→復(fù)性→延伸這三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)的產(chǎn)物作為下個(gè)循環(huán)的模板，如此循環(huán)多次，則DNA成指數(shù)擴(kuò)增。第二十七頁(yè)，本課件共有34頁(yè)P(yáng)CR反應(yīng)體系：

1.引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。

2.酶濃度酶催化的PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶量約需2.5U。

3.dNTP的質(zhì)量dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)，易變性失去生物學(xué)活性。

4.模板核酸模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。(二)PCR的基本反應(yīng)第二十八頁(yè)，本課件共有34頁(yè)1．可分析基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；構(gòu)建cDNA文庫(kù)；克隆特異cDNA；合成cDNA探針。2．可判斷突變的基因片段，如癌基因和抑癌基因中點(diǎn)突變的檢測(cè)和鑒定。3．用于病原微生物的微量檢測(cè)及鑒別菌株；突變基因的篩選；法醫(yī)學(xué)鑒定；DNA序列分析；器官移植配型等。4．應(yīng)用于遺傳性疾病的診斷如地中海貧血、苯丙酮酸尿癥等；感染性疾病如肝炎、結(jié)核等診斷。5．根據(jù)已知致癌基因順序設(shè)計(jì)特異的模板和引物，用于篩選特異的抗腫瘤化合物。(三)PCR