323DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定-導(dǎo)學(xué)案-2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

高二生物導(dǎo)學(xué)案第三章第2節(jié)《DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定》導(dǎo)學(xué)案3班級姓名【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1.了解PCR和電泳鑒定的基本原理。2.嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物?！绢A(yù)習(xí)案】一、實驗原理1．DNA片段的擴(kuò)增PCR利用了原理，通過來控制DNA雙鏈的。2．瓊脂糖凝膠電泳(1)帶電粒子：DNA分子具有，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上。(2)遷移動力與方向：在的作用下，帶電分子會向著與它所帶電荷的電極移動，這個過程就是電泳。(3)遷移速率：在凝膠中DNA分子的遷移速率與、有關(guān)。(4)檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為下被檢測出來。二、方法步驟1．移液：用按照配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入。2．：待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。3．離心：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約，使反應(yīng)液集中在管的。4．反應(yīng)：將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)。5．根據(jù)待分離的DNA片段的大小，用配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的瓊脂糖溶液，并加入混勻。6．將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。7．接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為。待指示劑前沿遷移接近時，停止電泳。8．電泳結(jié)束后，取出凝膠置于下觀察和照相。三、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行處理。2．緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在儲存。使用前將所需試劑從冰箱拿出，放在融化。3．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的。4．在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套?！咎接懓浮刻接扅c1.未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的主要原因有哪些？探討點2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的主要原因有哪些？探討點3.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？探討點4.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因?！緳z測案】（）1.下列關(guān)于電泳的說法，錯誤的是A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動C．DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度有關(guān)D．用瓊脂糖凝膠電泳，DNA的電泳遷移速率完全取決于分子的大小（）2.用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號為蒸餾水，PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間B．3號樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號確定反應(yīng)體系等對結(jié)果沒有干擾（）3.下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃儲存C．將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在高溫環(huán)境中迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換（）4.下列關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實驗的敘述，錯誤的是A．PCR過程需要TaqDNA聚合酶B．PCR過程通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合C．PCR擴(kuò)增區(qū)域由兩種引物來決定D．電泳時，DNA的遷移速率與凝膠的濃度有關(guān)，與DNA分子的大小無關(guān)（）5.(2021·北京海淀區(qū)模擬)在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因表達(dá)載體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖所示。以下相關(guān)敘述錯誤的是A．該載體最可能為環(huán)狀DNA分子B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點C．限制酶R1與R2的酶切位點最短相距約200bpD．限制酶切割時會導(dǎo)致作用位點的氫鍵和肽鍵斷裂（）6.下列關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定步驟的說法，錯誤的是A．PCR過程中，需要加入兩種引物B．所有組分加入微量離心管后，需要放入離心機(jī)離心約10sC．將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜D．電泳出現(xiàn)位置不等的幾條條帶，說明鑒定的PCR產(chǎn)物比較純凈（）7.用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，下列敘述錯誤的是A．第一輪復(fù)制得到2個DNA分子，即①②各一個B．第二輪復(fù)制得到4個DNA分子，即①②③④各一個C．第三輪復(fù)制得到8個DNA分子，其中有2個是等長的，也就是有2個X基因D．第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，其中有4個X基因（）8.(2021·江蘇南通模擬)PCR擴(kuò)增時需考慮高質(zhì)量的基因組DNA模板以及反應(yīng)體系中各種組分的優(yōu)化組合，下列相關(guān)敘述錯誤的是A．反應(yīng)體系中模板DNA的量和純度影響PCR的成功與否B．設(shè)計引物時需考慮引物的長度、堿基序列和G—C含量C．TaqDNA聚合酶的濃度過低會引起非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的增多D．目標(biāo)DNA的獲得取決于引物在模板DNA上的結(jié)合位置（）9.下列關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定原理的敘述,正確的是 A.在一定的pH條件下DNA分子可帶上正電荷或負(fù)電荷B.帶電DNA分子在電場的作用下會向著與它所帶電荷相同的電極移動C.DNA分子在凝膠中的遷移速率與DNA分子大小、構(gòu)象等有關(guān),與凝膠等無關(guān)D.凝膠中的DNA分子直接可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測10.新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒,外面包裹著衣殼蛋白和囊膜,囊膜上存在刺突蛋白,能特異性識別細(xì)胞膜上的ACE2受體從而感染細(xì)胞。常用“熒光RTPCR技術(shù)”進(jìn)行檢測,方法是取檢測者的mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,并大量擴(kuò)增,同時用熒光標(biāo)記的新型冠狀病毒核酸探針來檢測PCR產(chǎn)物中是否含有新型冠狀病毒的cDNA。請回答下列問題:探究:(1)上述“熒光RTPCR技術(shù)”所用的試劑盒中通常都含有哪些物質(zhì)?(2)由于核酸檢測比較費時費力,現(xiàn)已開發(fā)出多款針對新型冠狀病毒的抗原或抗體檢測試劑盒,可在更短時間內(nèi)得出檢測結(jié)果。假如你是一名科研人員,現(xiàn)提供新型冠狀病毒刺突蛋白基因、能產(chǎn)生專一針對新型冠狀病毒抗體的B細(xì)胞及其他相關(guān)的生物學(xué)材料,請運用現(xiàn)代生物技術(shù),設(shè)計一款能夠快速大規(guī)模生產(chǎn)、針對新型冠狀病毒抗原或抗體檢測的試劑盒,簡要寫出生產(chǎn)試劑盒的設(shè)計思路(只寫出針對抗原或抗體檢測的一種方案即可)。第三章第2節(jié)《DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定》導(dǎo)學(xué)案3解析一、實驗原理1．DNA片段的擴(kuò)增PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。2．瓊脂糖凝膠電泳(1)帶電粒子：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。(2)遷移動力與方向：在電場的作用下，帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。(3)遷移速率：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)。(4)檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。二、方法步驟1．移液：用微量移液器按照配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。2．混合：待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。3．離心：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在管的底部。4．反應(yīng)：將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)。5．根據(jù)待分離的DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液，并加入適量的核酸染料混勻。6．將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。7．接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。8．電泳結(jié)束后，取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。三、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2．緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4．在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套?！咎接懓浮刻接扅c1.未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的主要原因有哪些？(1)TaqDNA聚合酶失活。(2)引物出現(xiàn)質(zhì)量問題。(3)Mg2＋濃度過低。(4)變性時的溫度低，變性時間短。探討點2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的主要原因有哪些？(1)模板DNA出現(xiàn)污染。(2)引物特異性不強(qiáng)或形成引物二聚體。(3)Mg2＋濃度過高。(4)復(fù)性時的溫度過低等。探討點3.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？【提示】可以通過在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的結(jié)果。探討點4.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。【提示】如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取Ｈ绻麛U(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等?！緳z測案】1D解析DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。2B解析PCR過程中，可以通過設(shè)計特定的引物來擴(kuò)增特定的DNA片段，4～9號是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號野生型和10號蒸餾水組的結(jié)果，推測包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500bp，A正確；3號PCR結(jié)果包含250～500bp片段，應(yīng)包含目的基因，B錯誤；9號PCR結(jié)果不包含250～500bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C正確；10號放入蒸餾水，可排除反應(yīng)體系等對結(jié)果的干擾，D正確。3C4D解析PCR反應(yīng)需要高溫使DNA變性解旋，所以復(fù)制過程中要用耐高溫的DNA聚合酶，A正確；PCR過程中DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制需要引物，由于DNA的兩條模板鏈反向平行，所以復(fù)制時需要兩種引物，且PCR擴(kuò)增區(qū)域由這兩種引物來決定，C正確；電泳時，DNA的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，D錯誤。5D解析當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時，僅產(chǎn)生一種長度約為800bp的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，A正確；兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；兩種限制酶同時切割時則產(chǎn)生長度約為600bp和200bp的兩種DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點最短相距約200bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點的磷酸二酯鍵，D錯誤。6D解析電泳出現(xiàn)位置不等的幾條條帶，說明存在長短不一的DNA片段，鑒定的PCR產(chǎn)物不純凈，D錯誤。7D解析第二輪復(fù)制得到4個DNA分子，①復(fù)制得到①和③，②復(fù)制得到②和④，故得到①②③④各一個，B正確；第三輪復(fù)制得到8個DNA分子，①復(fù)制得到①和③，③復(fù)制得到③和⑤，②復(fù)制得到②和④，④復(fù)制得到④和⑤，故得到①和②各一個，③和④各兩個，⑤兩個且等長，即2個X基因，C正確；第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，①復(fù)制得到①和③，②復(fù)制得到②和④，兩個③復(fù)制得到兩個③和兩個⑤，兩個④復(fù)制得到兩個④和兩個⑤，兩個⑤復(fù)制得到四個⑤，故第四輪復(fù)制得到的16個DNA分子中有8個X基因，D錯誤。8C