DB14∕T 1177-2016 大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR 檢測規(guī)程

DB14DB14/T1177—2016大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR檢測規(guī)程2016-03-30發(fā)布2016-05-30實施山西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 2 2 4 4 5 5 6 7前□□言1大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR檢測規(guī)程本標準規(guī)定了大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR檢測的術(shù)語和定義、試劑儀器材料、樣品DNA提取、NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求NY/T673轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣NY/T2162棉花抗棉鈴蟲性鑒定方法2內(nèi)標基因Sad1Stearoyl-acylcarrierproteindesaturas利用核苷酸擴增儀通過一個包括DNA序列變性、退火引物與模板鏈結(jié)合、目標序列延伸的不斷循環(huán)的過稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于803稱取69.36g葡萄糖于1L燒杯，加500mL純凈水，充分溶解后，加入100mL1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，10mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，200mL10%聚乙烯基乙醇，充分混勻，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)浞Q取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL純凈水中，用濃鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，用純稱取18.61g乙二胺四乙酸二鈉溶解于800mL純凈水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，用純凈水定容至稱取81.8g氯化鈉于1L燒杯，加300mL純凈水，充分溶解后，加入1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸取植株嫩葉0.1g～0.2g，加入預(yù)冷的新鮮配制的提4加入24:1的氯仿∶異戊醇混合液400μL，緩慢翻轉(zhuǎn)30次以上，泛白即可，8000rpm離min，將上清液轉(zhuǎn)入1.5mL的干凈離心管中，加0.(pH8.0，500mmol/L)，用冰乙酸調(diào)至pH8.6.2NPTII基因的檢測NPTII基因為抗抗卡納霉素基因。引物見附錄A。抗蟲基因檢測是對編碼Bt蛋白的外源cry1Ac基因或cry1Ab基因,或者是由cry1Ac和cry1Ab融合的基包括CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV35S終止子等植物轉(zhuǎn)化5配制0.8%～1%瓊脂糖凝膠。稱取0.8電泳結(jié)束后，取出凝膠，在凝膠成像儀中觀測。根據(jù)DNA分子量標準估計擴增條帶大小，將電泳結(jié)果拍照形成電子文件存檔。如需通過序列分析確認PCR擴增片段是否為目標DNA片段，可通過凝膠與引物擴增目標大小不一致，表明不能檢測到目應(yīng)詳細記錄植株名稱、田間檢測、DNA檢測、凝膠電泳等檢測結(jié)果，并建立檔案。檢測記錄格式6 ’NptIINpt-F685’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’Npt-R356Bt基因CaMV反向引物35S-R1FMV5’-AGGACAGCTCTTTTCCACGTT-3’NOS5’-GCCGTTTTACGTTTGGAACTG-3’NOS5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’CaMV