GENE-ENGINEERING基因重組與基因工程

基因重組與基因工程

GeneticRecombination&GeneticEngineering

PauI

Berg(保羅.伯格)1973年發(fā)明重組DNA技術(shù)榮獲1980年諾貝爾化學獎

臺灣動物科技研究所2003年

中山大學實驗動物中心陳系古教授2000年法國科學家，兔子“Alba”著譯者:黃培堂

出版者：科學出版社

出版時間：2002.09

原著：J.薩姆布魯克

D.W.拉塞爾定價：￥168.00

字數(shù)：2917千字

頁數(shù)：1949頁

中譯本序/譯者的話/第三版前言上冊第1章質(zhì)粒及其在分子克隆中的應(yīng)用第2章λ噬菌體及其載體第3章M13噬菌體載體第4章高容量載體的應(yīng)用第5章DNA凝膠電泳和脈沖場瓊脂糖凝膠電泳第6章真核基因組DNA的制備和分析第7章真核mRNA的提取、純化和分析第8章聚合酶鏈式反應(yīng)體外擴增DNA第9章放射性標記DNA探針與RNA探針的制備第10章合成寡核苷酸探針第11章cDNA文庫制備及其基因鑒定下冊第12章DNA測序第13章誘變第14章表達文庫的篩選第15章在大腸桿菌中表達克隆化基因第16章哺乳動物培養(yǎng)細胞中導入克隆化基因第17章哺乳動物培養(yǎng)細胞的基因表達分析第18章蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)附錄1分子克隆中使用的緩沖液和試劑的配制附錄2培養(yǎng)基附錄3載體和細菌菌株附錄4分子克隆所用的酶附錄5酶的抑制物附錄6核酸附錄7密碼子和氨基酸附錄8分子克隆中的常用技術(shù)附錄9檢測系統(tǒng)附錄10DNA陳列技術(shù)附錄11生物信息學附錄12告戒附錄13供應(yīng)商附錄14商標索引引言第一節(jié)基因工程的基本程序第二節(jié)基因工程常用的工具酶第三節(jié)基因工程常用的載體第四節(jié)基因工程在醫(yī)學和制藥工業(yè)中的應(yīng)用

目的要求：

1.掌握重組DNA和基因工程的基本概念；

2.掌握基因工程的基本程序;

3.熟悉基因工程在醫(yī)學和制藥工業(yè)中的應(yīng)用；

4.了解基因工程常用的工具酶和載體。21世紀核心的科學技術(shù)：

現(xiàn)代生物技術(shù)(生物工程)

計算器微電子技術(shù)新材料新能源航天技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)：

基因工程（核心技術(shù)）蛋白質(zhì)工程酶工程細胞工程引言分子克隆(molecularcloning)DNA克隆(DNAcloning)基因克隆(genecloning)重組DNA(recombinantDNA)分子克隆技術(shù)(molecularcloningtechnique)DNA克隆技術(shù)(DNAcloningtechnique)基因克隆技術(shù)(genecloningtechnique)重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique)

基因工程(geneengineering)引言重組DNA(recombinantDNA)：

就是對不同生物的遺傳物質(zhì)——目的基因，在體外使用一種工具酶，用人工的方法，進行“剪切”、“組合”、“拼接”，使遺傳物質(zhì)按照我們的意愿重新組合，然后通過運載物質(zhì)（質(zhì)粒、噬菌體、病毒等）轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)或動、植物細胞內(nèi)（統(tǒng)稱載體），進行無性繁殖，并使我們需要的基因在細胞中表達出來，產(chǎn)生出我們所需要的產(chǎn)物或組成新的生物類型。引言

重組DNA是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序?；蚬こ?geneengineering):

是指重組DNA的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游和下游兩大組成部分。上游部分指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA）；而下游部分則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。

實現(xiàn)重組DNA所采用的方法及相關(guān)的工藝統(tǒng)稱基因工程。

理論基礎(chǔ)：①不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；②基因是可切割的；③基因是可以轉(zhuǎn)移的；④多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系；⑤遺傳密碼是通用的；⑥基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代。歷史：1973Cohen第一例成功的克隆實驗1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），

中國轉(zhuǎn)基因魚

1993基因工程西紅柿在美國上市1997英國羅斯林研究所多莉羊1999.9中國獲準加入人類基因組計劃.負責測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息胰島素人生長激素干擾素白細胞介素2粒細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子紅細胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體體內(nèi)-體外第一節(jié)基因工程的基本程序獲得目的基因和載體；目的基因和載體的連接(體外重組)；連接產(chǎn)物(重組體)導入宿主細胞；重組體的擴增、篩選；目的基因在細胞中的表達、分離、純化、鑒定等。載體目的片斷酶切酶切重組體連接導入細胞篩選擴增、表達、純化等獲得目的基因和載體——切目的基因和載體的連接(體外重組)——接連接產(chǎn)物(重組體)導入宿主細胞——轉(zhuǎn)重組體的擴增、篩選——篩目的基因在細胞的表達、分離、純化、鑒定等。一、目的基因的獲得1、化學合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。

局限性：短片段、簡并性、高費用2、基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)

存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌

3、cDNA文庫：

以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫(cDNAlibrary)。組織或培養(yǎng)細胞載體mRNAcDNAcDNA與載體連接導入大腸桿菌鑒定cDNA文庫的克隆數(shù)與特征4、PCR方法獲?。憾⒅亟MDNA導入受體細胞感受態(tài)：指受體(或者宿主)處于最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。將宿主菌在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)16-20h。挑取單菌落轉(zhuǎn)入20mlLB培養(yǎng)基錐瓶中，37℃振蕩過夜。從中取2ml菌液轉(zhuǎn)入50mlLB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)4-5h，測OD600達0.4-0.5。培養(yǎng)物于冰上10min。轉(zhuǎn)入50ml離心管，于4000rpm下4℃離心10min。棄上清，倒置離心管1min，流盡剩余殘液然后加入10ml冰預(yù)冷的0.1MCaCl2，置冰上10min。4000rpm4℃離心10min，棄上清。加入2ml，0.1MCaCl2懸浮細胞，于4℃過夜。#感受態(tài)細胞制備轉(zhuǎn)化(transformation)：在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌體內(nèi)，使之獲得新遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)染(transfection):

指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導入真核細胞的過程。感染(infection):

以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當?shù)募毎?，并在細胞?nèi)擴增。轉(zhuǎn)導(transduction):

指以噬菌體為載體，在細菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過程，有時也指在真核細胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細胞DNA的過程。

1.重組體導入大腸桿菌

（1）氯化鈣法（2）電穿孔法(electroporation)

（3）病毒感染法/體外包裝法#氯化鈣轉(zhuǎn)化法在1.5mlEppendorf管中加入200μl感受態(tài)細胞和10μl40ngDNA溶液，溫和混勻，于冰上30min。于42℃水浴90S。冰浴2min。加入800μlLB液體培養(yǎng)基37℃45min。取200μl涂布于含Amp(50μg/ml)瓊脂糖平皿，37℃培養(yǎng)12-16h，觀察結(jié)果。#電穿孔法DNAMovement2.重組體導入哺乳動物細胞

（1）磷酸鈣共沉淀法

（2）脂質(zhì)體介導法：人工細胞膜（3）病毒感染法（4）顯微注射法三、

DNA重組體的篩選與鑒定1.根據(jù)重組載體的表型進行篩選普通抗菌素平板篩選：插入失活篩選：

α-互補——藍-白斑篩選：含LacZ基因（編碼β半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍色，從而使菌株變藍。當外源DNA插入后，LacZ基因不能表達，菌株呈白色，以此來篩選重組細菌。稱之為藍-白斑篩選。IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)

2.DNA限制酶切圖譜分析

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

3.PCR鑒定4.利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定

★基因工程的基本程序獲得目的基因和載體——切目的基因和載體的連接(體外重組)——接連接產(chǎn)物(重組體)導入宿主細胞——轉(zhuǎn)重組體的擴增、篩選——篩目的基因在細胞的表達、分離、純化、鑒定等?；蚬こ碳夹g(shù)策略分：

基因載體

目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒直接分離cDNA

人工合成基因文庫切：

限制性內(nèi)切酶有缺口的載體目的基因接：

連接酶粘端連接平端連接尾接法重組體轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主篩：表型篩選電泳法核酸雜交第二節(jié)基因工程常用的工具酶工具酶

活性限制性核酸內(nèi)切酶

識別特異序列，切割DNA連接酶

催化5'-磷酸與3'-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶

以DNA為模板合成DNARNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)

以RNA為模板合成DNA堿性磷酸酶

切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶

催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚體尾一、限制性核酸內(nèi)切酶概念：是由細菌產(chǎn)生的一種能識別雙鏈DNA中的特定序列，并以內(nèi)切方式水解核酸鏈中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶，又叫切割酶或限制酶。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。以Ⅱ型為主。命名原則：常用限制性內(nèi)切酶的種類：#識別和切割位點：

5‘粘性末端：

5‘-GAATTC-3’

5’-G

AATTC-3’

3‘-CTTAAG-5’

3’-CTTAA

G-5’3‘粘性末端：

平端或鈍端：EcoRⅠ+二、連接酶與連接連接方式：

三、DNA聚合酶分類：

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶大片段（Klenow片段）

TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶：耐受高溫，70-75℃時具有最佳的生物活性。主要用于PCR。四、RNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)作用：

RT-PCR

RNADNA

第三節(jié)基因工程常用的載體載體(vector)：

裝載目的基因的工具。

本質(zhì)是DNA。分類：克隆載體；表達載體。常用的載體：

質(zhì)粒(plasmid)；

噬菌體(phage)；

酵母載體(yeastvector)；

病毒載體(virusvector)。質(zhì)粒(plasmid)：

是細菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA

質(zhì)粒(plasmid)：

基本特征：復(fù)制起點啟動子多克隆位點加尾信號篩選標記載體的選擇標準(以質(zhì)粒為例)：能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(外源DNA插入點)，常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。作用：裝載小于2kb的目的DNA質(zhì)粒(plasmid)：

2.噬菌體(phage)：

感染細菌的病毒稱為噬菌體。

作用：裝載大片斷DNA，從6-8kb、

10-20kb、30-45kb不等吸附吸附是噬菌體與菌體表面受體發(fā)生特異性結(jié)合的過程，其特異性取決于噬菌體蛋白與宿主菌表面受體分子結(jié)構(gòu)的互補性。毒性噬菌體的復(fù)制周期—溶菌性周期3.酵母載體(yeastvector)：

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)：可接受2Mb的外源

DNA插入，是人類

基因組計劃物理圖

普繪制采用的主要載體。4.病毒載體(virusvector):

作用：在真核細胞或者哺乳動物細胞中表達外源基因。種類：

昆蟲桿狀病毒載體；

SV40病毒載體；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；

腺病毒載體；

痘苗病毒載體等。第四節(jié)基因工程

在醫(yī)學和制藥工業(yè)中的應(yīng)用一、醫(yī)學基礎(chǔ)研究★當今人類疾病的發(fā)展趨勢：

★研究疾病的分子機制：

二、基因診斷

1.基因探針——基因水平的診斷：

親子鑒定：“爆棚”現(xiàn)象

產(chǎn)前診斷：

個人基因信息身份證：

2.抗原或者抗體——蛋白質(zhì)水平：乙肝核心抗原/e抗原：三、基因治療1.基因治療的概念

狹義指將具有正常功能的基因置換或者增補體內(nèi)缺陷的基因，從而達到治病的目的。

廣義指將某遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達，最終達到治療某種疾病的方法，均謂之基因治療。2.基因治療的方式基因修復(fù)/矯正(genecorrection)基因置換(genereplacement)基因增補/修飾(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)：

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)

基因敲除(geneknock-out)自殺基因(suicidegene)

單純皰疹病毒胸苷激酶基因HSV-

tk(丙氧鳥苷GCV-磷酸化GCV)1990年，美國科學家成功治愈了患有嚴重復(fù)合型免疫缺陷疾病(SCID)(腺苷酸脫氨酶缺陷)的4歲女孩艾姍蒂。用基因治療血友病四、轉(zhuǎn)基因動物

GFP

我國培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔體內(nèi)整合并表達。

兔研人員將乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。美國通過基因工程將人的基因植入牛的體內(nèi)，由轉(zhuǎn)基因公牛受精的母牛產(chǎn)下5頭健壯的牛犢，每頭都含有一個人類的基因。

1998年，中國人-曹誼林在美國麻省大學查里斯?文森提(CharlesVacanti)的實驗室創(chuàng)造該奇跡。

中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速生長效應(yīng)。五、生物制藥(包括疫苗和抗體)為什么？

隨心所欲

低成本劇增效應(yīng)等我國第一個實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的生物高技術(shù)產(chǎn)品，人α型基因工程干擾素。1309元/支，14支/盒，21天1個療程世界生物技術(shù)藥品市場：世界生物技術(shù)藥品市場：1——1996年；2——1997年；3——2000年；4——2003年。中國生物技術(shù)藥品市場：截至目前，我國