分子生物學第六章-分子生物學操作技術二

第六章分子生物學操作技術二1第六章分子生物學操作技術二——基因功能研究技術2本章內(nèi)容第一節(jié)基因表達研究技術第二節(jié)基因功能研究策略第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術第四節(jié)基因芯片及數(shù)據(jù)分析第五節(jié)其他分子生物學技術第六節(jié)功能基因組學3大規(guī)模分析基因表達水平因為EST是從某一特定組織的cDNA文庫中隨機測序而得，所以可用未經(jīng)標準化和差減雜交的cDNA文庫EST分析特定組織的基因表達譜?；虮磉_系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE）。SAGE是一種用于定量、高通量基因表達分析的實驗方法。DNA微陣列或基因芯片的研究。高密度寡核苷酸cDNA芯片或cDNA微陣列是一種新的大規(guī)模檢測基因表達的技術，具有高通量分析的優(yōu)點。4第一節(jié)基因表達研究技術一、基因表達系列分析技術（SAGE）SAGE是以DNA序列測定為基礎分析全基因組表達模式的技術。任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標簽數(shù)的比例可分析所對應基因的表達頻率。LongSAGE技術。標簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與ShortSAGE方法類似，只是用了不同的IIS類標簽酶（MmeI），并將程序做了相應修改。5常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程67SAGE技術流程8基因芯片技術流程二、RNA的選擇性剪接技術RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程?？煞譃椋浩胶饧羟?、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個基因是否存在選擇性剪切。果蠅Dscam基因可以通過可變剪接產(chǎn)生38000多種可能的mRNA異構(gòu)體9選擇性剪切的不同類型RT-PCR檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切10三、原位雜交技術原位雜交（ISH）是用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段，分為RNA和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析。11熒光原位雜交（FISH）首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。12四、基因定點突變技術通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術和大引物誘變法，在基因序列中進行定點突變。13寡核苷酸介導的DNA突變技術14重疊延伸介導的定點誘變大引物誘變法15五、其它研究基因表達技術實時熒光定量PCRNorthern、Southernblotting……16第二節(jié)基因功能研究策略抑制基因表達觀察功能變化KnockOut法Antisense法Ribozyme法RNAi法1718基因敲除又稱基因打靶（genetargeting）將一段無關DNA片段取代某一特定基因是最簡便的基因失活的方法。主要原理：在一段無關DNA片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的序列，將這一構(gòu)建導入目的細胞，由于同源片段之間的重組，可使無關片段取代靶基因，整合到染色體中。為了便于篩選，用于取代的外源DNA中含有報告基因。一、基因剔除（knock-out)基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應用最為廣泛。19用取代型（a）或插入型（b）載體進行完全基因敲除實驗20正負篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細胞21高等動物基因敲除技術真核生物基因敲除的技術路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導入胚胎干細胞純系中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達。顯微注射命中率較高，技術難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術基礎。2223tk胸苷激酶標記基因←gangcyclovir（GCV）neor新霉素抗性基因→G418232424模式動物小鼠中完全基因敲除的主要技術策略與應用。25植物基因敲除技術T-DNA插入失活技術是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導轉(zhuǎn)化，將帶有報告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達，從而使該基因“失活”。26植物基因敲除及突變體篩選a.引物設計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物，目的基因片段(設為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。

b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。27二、基因過表達用于功能檢測

通過增加基因的拷貝數(shù)和采用強啟動子促使基因超表達，致使受體表現(xiàn)出生長與發(fā)育的異常，來研究基因的功能。28三、反義技術

反義核酸技術主要是引入目的基因mRNA的反義序列或與目的基因互補配對的反義基因，通過它們的雜交而阻遏或降低目的基因表達的一種方法。當引入的反義核酸與相應序列互補配對后，用于表達目的基因的mRNA量大大減少，使細胞中靶基因編碼的蛋白合成量也大為減少。2930反義RNA作用機理：

A干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細胞降解。

B與mRNA的引導順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動。

C反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板，轉(zhuǎn)錄終止。31RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，它是指當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。四、RNA干擾322006NobelPrize

生理學（醫(yī)學獎)RNAinterference“沉默”是金33RNAi的發(fā)現(xiàn)1995年，GuoS等試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的par-1基因的表達。設計：反義RNA特異性地阻斷par-1基因的表達；正義RNA以期觀察到基因表達的增強。結(jié)果:

二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋。34RNAi的提出直到1998年2月，F(xiàn)ireA和MelloC才首次揭開這個懸疑之謎。他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應變得十分微弱；而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達。他們證實，GuoS博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNAinterference，簡稱RNAi）。

35RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲（C.elegans)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA36RNAi廣泛存在于自然界隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機制正在被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。

37體外實驗結(jié)果的提示體外實驗表明：RNAi反應中，加入的dsRNA被切割為21-23核苷酸長的RNA片段，后者使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長的片段。從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細胞中，Hammond等人部分純化了一種核酸酶，該核酸酶具有序列特異性，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么這種核酸酶是如何確定哪些mRNA該降解而哪些不該呢？由于在純化該核酸酶時，可以共分離出21-23核苷酸長的dsRNA片段，這暗示該核酸酶對mRNA的切割有可能是以這些片段作模板指導進行的。根據(jù)以上的實驗結(jié)果，人們提出一種RNAi作用的簡單模型。38RNAi作用的簡單模型當dsRNA導入細胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識別，切割成21-23核苷酸長的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識別目的mRNA。識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對mRNA進行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長的dsRNA小片段，與核酸酶形成復合物，繼續(xù)對目的mRNA進行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。通過遺傳分析的方法，目前已從線蟲中已分離到RDE-2、RDE-3和Mut-7等RNAi相關的基因。

39

RNA干擾的作用機制

長片段dsRNA在細胞內(nèi)被Ⅲ型RNA酶Dicer切成長度大約為21-23bp的小片段干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），由siRNA參與構(gòu)成復合物RISC（RNA-inducedsilencecomplex）。siRNA通過與同源mRNA的特異配對，引導RISC特異地降解同源mRNA，導致基因表達的抑制。因此小片段的siRNA也可以誘導高效的基因沉默。40dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表達的機理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNA41RNAi研究的一般技術路線42RNAi的生物學意義：一種古老、保守而又及其重要的遺傳學行為。生物體在長期的進化過程中對異?；蚧顒拥谋O(jiān)控和防御，有學者稱之為“基因組水平的免疫系統(tǒng)”。一種抗病毒感染機制。43RNAi技術的優(yōu)缺點RNAi最根本的特點是特異性RNAi具有特殊的穿越能力，如將雙鏈RNA注射在線蟲性腺里，它也會干擾到體細胞里的基因表達，而且干擾作用會傳給后代。RNAi對一些低水平表達的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯，而且?guī)讉€有相同或相似序列的基因，RNAi也會同時作用于它們。44RNA干擾的應用

1、研究基因功能的新工具；2、病毒性疾病的治療；3、遺傳性疾病的治療；4、腫瘤病的治療第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術一、酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術，可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得與靶序列相互作用蛋白的編碼基因。將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（Pmin）的上游，把報告基因連接到Pmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達載體導入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動子，使報告基因得到表達。45從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。

酵母單雜交的基本原理示意圖46二、酵母雙雜交系統(tǒng)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。BD能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。4748ReporterGeneBaitProteinBindingDomainPreyProteinActivationDomainGeneBindingDomainActivationDomain正常條件下Y2H中

酵母雙雜交的基本原理示意圖49三、體外蛋白質(zhì)相互作用技術1、FarWestern印跡技術Far-westernblotting是一種基于westernblotting的一種分子生物學方法。在Westernblotting中用抗體來檢測目標蛋白，而在Far-Westernblotting中用能夠與目標蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)。因此，Westernblotting用來檢測特定的蛋白，而Far-westernblotting則用于檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。用32P標記的體外表達蛋白作探針,直接檢測與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達該蛋白的cDNA。502、GST融合蛋白沉降技術利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。513、蛋白質(zhì)芯片技術蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點。524、等離子表面共振技術（surfaceplasmonresonancetechnology,SPR）將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米級厚度的金屬膜上。當?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，導致共振角度的改變。535、免疫共沉淀技術co-immunoprecipitation免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細菌的ProteinA或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法?；驹恚涸诩毎呀庖褐屑尤肟古d趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的ProteinA或G，若細胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—ProteinA或G”，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。545、免疫共沉淀技術co-immunoprecipitation將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復合物沉淀到試管的底部或微膜上。55絲狀噬菌體基因基因編碼產(chǎn)物功能gIpI噬菌體裝配gIIpII噬菌體基因組復制gIIIpIII尾端外殼蛋白，與F因子結(jié)合gIVpIV噬菌體裝配gVpV噬菌體基因組復制gVIpVI外殼蛋白，末端“塞子”gVIIpViI外殼蛋白，高度疏水，組裝起始信號gVIIIpVIII主要外殼蛋白gIXpIX外殼蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII啟動子激活蛋白6、噬菌體展示技術565758建庫5960四、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究

——熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）

當一個熒光分子（又稱為供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（又稱為受體分子）的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關，一般為7～10nm時即可發(fā)生FRET;隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱。61四、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究——熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：給體與受體在合適的距離（1～10nm）；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。62第四節(jié)基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片（DNAchip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術是能同時監(jiān)測大量靶基因表達的實驗手段，從而迅速準確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。63基因芯片及數(shù)據(jù)分析簡易基因芯片使用機械臂把DNA片段點在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過物理吸附作用達到固定化。也可以直接在玻璃板表面進行化學合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達模式?；蛐酒捎糜谶M行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖，用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，確定哪些基因的表達受抑制或激活。64第五節(jié)其他分子生物學技術一、凝膠滯緩實驗凝膠滯緩試驗（gelretardationassay），又叫作DNA遷移率變動試驗（DNAmobilityshiftassay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應縮短了。65EMSA實驗擬南芥轉(zhuǎn)錄因子與不同DNA元件有不同的結(jié)合能力。66二、蛋白質(zhì)磷酸化分析技術由于細胞內(nèi)可能有多達上千個蛋白激酶，體內(nèi)檢測某個蛋白激酶活性非常困難，科學家常用體外激酶活性分析法來檢測蛋白激酶活性。該方法能十分可靠地鑒定某個蛋白激酶對底物的磷酸化作用，篩查激酶的特異性底物。6768第六節(jié)功能基因組學MetabolomeProteomeTranscriptomeGenomeMetabonomicsMetabolomicsProteomicsTranscriptomicsGenomicsGenotypeMolecularPhenotypeMetabotype“Omics”WorldSystems

Biology69

InformationComplexityTheGeneticCodemetabolitesProteinSequencingtheGenomeisJusttheBeginningofanInformationWaveDNA/RNAPhenotype后基因組時代的生命科學研究70一、轉(zhuǎn)錄組學（Transcriptomics）1997年，Velculescu和Kinzler提出轉(zhuǎn)錄組概念轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）：一個細胞內(nèi)的一套mRNA轉(zhuǎn)錄物，包含了某一環(huán)境條件、某一生命階段、某一生理或病理（功能）狀態(tài)下，生命體的細胞或組織所表達的基因種類和水平。這一研究領域叫轉(zhuǎn)錄組學（transcriptomics）。71基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray72轉(zhuǎn)錄組學的研究方法－DNA芯片技術73轉(zhuǎn)錄組分析策略7475二、蛋白質(zhì)組學（Proteomics）

蛋白質(zhì)組是澳大利亞學者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個詞的雜合，意指proteinsexpressedbyagenome，即“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”。蛋白質(zhì)組定義：廣義上是指某種細胞或組織中基因組表達的所有蛋白質(zhì)；狹義上,可以指不同時期細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化。蛋白質(zhì)組學定義：研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領域稱為蛋白質(zhì)組學。蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容：分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量；確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、生物活性和特定功能等。76

研究基礎（1）生物學的發(fā)展，特別是基因組測序的完成為我們提供了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫；（2）生物質(zhì)譜和分離科學的進步為我們提供了分離和鑒定的必須手段；（3）計算機技術的提高，特別是生物信息學的發(fā)展為我們儲存和處理海量數(shù)據(jù)提供了有力的支持。77蛋白質(zhì)組研究更為復雜和困難：

蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目。

蛋白質(zhì)隨時間和空間而變化。

78蛋白質(zhì)組研究的技術特點和要求高分辨率高靈敏度高通量自動化規(guī)?；?9蛋白質(zhì)組研究的基本技術和儀器分離Gel-basedLiquid-basedHPLCFFESCX,RP,SECSDS,IEF2DE鑒定MSMALDI-TOF-MSESI-MSMS-MS2D-HPLCMALDI-TOF-TOFMALDI-Q-TOFESI-MS-MSGel-based/Liquid-based-MALDI/ESI-MS-MS計算機技術80蛋白質(zhì)組學實驗室所需條件示意81毛細管高效液相色譜儀（美國戴安公司）824700/4800ProteomicsAnalyzer

(美國ABI公司）83CalLC-ESIQ-TOFMS(美國Waters公司)84

NanoLCLTQFTICRMS(美國ThermoFINNIGAN公司)85雙向電泳蛋白質(zhì)組示意86蛋白水解，質(zhì)譜分析87

生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離感興趣蛋白點的切取圖像掃描和初步分析蛋白信息的初步獲得胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進一步驗證882DE蛋白質(zhì)組研究的基本技術路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定89蛋白質(zhì)2D電泳分析902-DE技術的缺點

極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術難于有效分離。

膠內(nèi)酶解過程費時、費力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化。

91實驗方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）肽混合物質(zhì)譜測定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS）選擇肽段裂解（PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS）計算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫）肽質(zhì)量檢索未解析碎片離子檢索酶切質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略92蛋白質(zhì)組學研究方法分類（1）蛋白質(zhì)定性分析（2）蛋白質(zhì)組相對定量分析方法①直接進行比較，包括SDS、2DE、HPLC；②標記方法，包括同位素標記親和標簽（ICAT）、等量標簽相對和絕對定量方法（iTRAQ）、元素標記親和標簽（ECAT）、DIGE技術和同位素氨基酸細胞培養(yǎng)標記（SILAC）。③酶促同位素標記法，如18O標記。93優(yōu)勢：熒光試劑靈敏度可達到100pg-ng；動態(tài)范圍高達4-5個數(shù)量級；可同時顯示所有差異蛋白；同一塊膠內(nèi)可比較三個不同的樣品；內(nèi)標的使用可進一步克服雙向凝膠電泳發(fā)展至今的一個瓶頸——重現(xiàn)性的問題：包括膠-膠以及操作者-操作者的重現(xiàn)性；通過統(tǒng)計分析，可以更加準確地進行蛋白質(zhì)組差異分析，減少系統(tǒng)誤差，從而使實驗結(jié)果能準確反映生理病理過程中的差異問題。

2D-DIGE技術的實驗流程雙向電泳不同波長掃描得到三個樣品的圖像DeCyder軟件圖像分析找出差異蛋白標記好的樣品等量混合Cy3Cy2Cy5標記疾病2Cy2標記內(nèi)標（各實驗組等量混合）Cy3標記正常1Cy594（3）蛋白質(zhì)組絕對定量分析方法①基于外標或內(nèi)標法進行蛋白質(zhì)絕對定量；②基于凝膠電泳進行蛋白質(zhì)絕對定量方法；③無標記（labelfree）定量模型如：基于蛋白質(zhì)的量與其被質(zhì)譜鑒定到的肽段數(shù)正相關；基于spectralcount的蛋白質(zhì)組定量模型；基于不同歸一化指標與蛋白質(zhì)濃度的關系；基于蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測的spectralcounts和肽段鑒定概率；基于理論肽段占總肽段的分數(shù)近似等于實際測定的MSMS掃描次數(shù)占總掃描次數(shù)的分數(shù)。95一些研究熱點在疾病蛋白質(zhì)組領域提交的論文摘要中，約有一半在做biomarker；在疾病蛋白質(zhì)組領域提交的論文摘要中，約有一半在做癌癥研究。96ICAT、iTRAQ尋找HCC組織biomarkerSERPA（serologicalimmunoscreeningoftumourantigens）：利用HCC病人自身免疫產(chǎn)生的抗體篩選biomarker，這個想法很不錯。DIGE研究butyrate治療HCC97每年有5000多篇關于biomarker的報道，但很少有應用于臨床的；尋找biomarker不應只局限于一種技術，從單一技術獲得的信息并不足以令人相信。98蛋白折疊等二級、三級結(jié)構(gòu)信息，以及修飾等信息也與癌癥等緊密相關，也會影響biomarker的尋找，應有相關研究，但目前尚無。尋找biomarker的主要困難：技術單一樣品復雜99肺癌biomarker尋找胃癌biomarker尋找這兩個實驗都找到了由于各自癌癥引發(fā)變化的蛋白，但并不是肺癌或胃癌特異的biomarker。100蛋白質(zhì)組技術開啟了biomarker的尋找；但仍處于起步階段，技術發(fā)展至關重要，比如蛋白分離、鑒定蛋白的定量。101蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫11.PIR和PSDPIR國際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(PSD)是由蛋白質(zhì)信息資源(PIR)、慕尼黑蛋白質(zhì)序列信息中心(MIPS)和日本國際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(JIPID)共同維護的國際上最大的公共蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。PIR和PSD的網(wǎng)址是：/。2.SWISS-PROTSWISS-PROT是經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由歐洲生物信息學研究所(EBI)維護。SWISS-PROT的網(wǎng)址是：http://www.ebi.ac.uk/swissprot/。1023.PROSITEPROSITE數(shù)據(jù)庫收集了生物學有顯著意義的蛋白質(zhì)位點和序列模式，并能根據(jù)這些位點和模式快速和可靠地鑒別一個未知功能的蛋白質(zhì)序列應該屬于哪一個蛋白質(zhì)家族。PROSITE的網(wǎng)址是：http://www.expasy.ch/prosite/。4.PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)倉庫(PDB)是國際上唯一的生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)檔案庫，由美國Brookhaven國家實驗室建立。RCSB的PDB數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址是：/pdb/。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫2103MarineBiotechnology,2008,10:527-537.105NAFLD蛋白質(zhì)組學研究－差異蛋白鑒定比較差異蛋白上調(diào)蛋白下調(diào)蛋白M2/C21162987M5/C51436281M8/C8355150205鑒定的總體差異蛋白DIGE制備膠106NAFLD蛋白質(zhì)組學研究－數(shù)據(jù)分析及驗證1.GOfact分析－生物學過程2.Cluster分析3.

IngenuityPathway分析

－分子相互作用網(wǎng)絡CD8wMCDCD5wMCDCD2wMCDPPARαGAPDHBHMTASS2周明顯上調(diào)的分子：1.結(jié)合還原性谷胱甘肽：如GSTP1;2.細胞內(nèi)長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運：如FABP,ACTG;3.抑制絲氨酸蛋白酶：如PRDX1。

2周明顯下調(diào)的分子1.主要參與氨基酸的生物合成：如ASSY；2.二氧化碳的可逆水合：如CA3;3.保護細胞免受毒性損傷：如CATA;4.調(diào)節(jié)腺苷蛋氨酸和蛋氨酸：如GNMT。2周分子網(wǎng)絡-主要參與

1.代謝性疾病2.分子轉(zhuǎn)運107三、代謝組代謝組（metabolome）是指一個細胞、組織或器官中所有代謝物的集合,包含一系列不同化學型的分子,比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質(zhì)的催化產(chǎn)物等。代謝組學來源于代謝組一詞,是研究一個細胞、組織或器官中所有小分子代謝組分集合的科學。

代謝組學研究的目的是定量分析一個生物系統(tǒng)內(nèi)所有代謝物的含量。代謝組學分析可以指示細胞、組織或器官的生化狀態(tài),協(xié)助闡釋新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代謝網(wǎng)絡間的關聯(lián)性,幫助人們更系統(tǒng)地認識生物體。108代謝組學概念的提出1999年,ImperialCollege的Nicholson等人基于近20年的研究，提出了代謝組學的概念109The“Omics”Cascade

Metabolomics:

what’shappeningdownstreamofDNA?轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學等可同時檢測大量基因或蛋白質(zhì)的表達變化情況，但這些變化不能與生物學功能的變化建立直接聯(lián)系。

代謝組學方法則可為代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關性。110代謝組學的特點任何外源性物質(zhì)、病理生理變化或遺傳變異的作用都會反映到各種生物學途徑上，對機體新陳代謝的穩(wěn)態(tài)平衡產(chǎn)生干擾，從而使內(nèi)源性代謝產(chǎn)物中各種物質(zhì)的濃度和比例發(fā)生變化。代謝組是細胞內(nèi)各種生物學過程的終產(chǎn)物，是反映各種生命活動狀態(tài)的信號放大器，如遺傳變異、疾病、藥物、飲食和環(huán)境因素影響等。代謝組學研究機體在某一時刻所有代謝物的集合，反映了機體所處的環(huán)境，這又與機體的營養(yǎng)狀態(tài)，藥物和環(huán)境污染物的作用，以及其它外界因素的影響密切相關。111代謝組學可以研究代謝產(chǎn)物譜的動態(tài)變化過程，可以反映出生物學過程的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)果的全過程。每一種影響因素都會在生物體中產(chǎn)生特征的內(nèi)源代謝譜模式，這種特征包含了生物效應的機理和作用位點的信息。生物體液或組織中代謝物組成和水平的變化直接反映了生物體對這些影響因素的綜合應答，能夠展示形態(tài)學和傳統(tǒng)生化指標不能區(qū)分的表型。代謝組學的特點112代謝組研究的層次代謝物靶標分析：某個或某幾個特定組分的分析代謝輪廓分析：少數(shù)預設的一些代謝產(chǎn)物的定量分析代謝組學：限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量代謝物指紋分析：不分離鑒定具體單一組分,而是對樣品進行快速分類(如表型的快速鑒定)113114代謝組學的研究樣品體液尿液血漿（血清）腦脊液前列腺液唾液細胞細胞提取液組織完整組織組織提取液115代謝組學研究工具NMRMS-hyphenatedLC-MS（Q,IT,TOF）GC-TOF/MSFT-ICR-MS

HPLCCEFT-IR116生物體液色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析高分辨液體NMR分析不揮發(fā)性組分高分辨魔角旋轉(zhuǎn)NMR分析揮發(fā)性組分組織樣本衍生化GC-TOF/MS去卷積、峰識別、峰對齊、歸一化數(shù)據(jù)庫查詢代謝指紋譜代謝物指認多元統(tǒng)計分析特征代謝物譜圖數(shù)據(jù)處理代謝指紋譜文獻、數(shù)據(jù)庫查詢多元統(tǒng)計分析特征代謝物代謝物指認毒性、藥理作用、疾病相關代謝標志物代謝組學數(shù)據(jù)庫動物實驗或臨床樣本采集不同色譜柱LC-ESI/APCI-MS提取液代謝組學分析技術路線圖組織病理學觀察生化分析117(JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002)基于NMR技術的代謝組學分析流程樣本采集譜圖采集模式識別生物標志物數(shù)字化處理數(shù)據(jù)庫建立模型預測動物實驗118樣品提取樣品預處理化合物分離數(shù)據(jù)分析可視化建立模型固相微萃取固相萃取親和色譜氣相色譜液相色譜法毛細管電泳光譜質(zhì)譜核磁共振電化學生物信息學化學信息學計算生物學檢測及鑒定自動進樣體液組織等基于色譜-質(zhì)譜技術的代謝組學分析流程119NMR研究代謝組學的特點優(yōu)點無損傷性樣品前處理簡單能夠檢測到在檢測限內(nèi)的所有有機化合物譜峰強度能夠反映出化合物的相對含量缺點靈敏度低,解決方法：超低溫探頭，靈敏度提高4倍，可檢測到ug級

CapNMR，

10，~10ng120代謝組學研究應用領域代謝組學的應用范圍包括生命科學的主要領域及與人類活動密切相關的領域：

a．創(chuàng)新藥物的研發(fā)中的藥物安全性和藥效評價；

b．重大疾病的發(fā)病機制、早期診斷和預后；個性化治療

c．中醫(yī)藥現(xiàn)代化（復方藥理、毒理，中醫(yī)證候模型等）

d．功能基因組學；

e．微生物工程、生物安全；

f．營養(yǎng)基因組學，個性化營養(yǎng)學；

g．食品安全；

h．環(huán)境毒理。121NAFLD機制和標志物的代謝組學研究122123124125126127P1=1+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)P2=1+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)P3=1+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)P0=11+e(-2.528-0.002X1+0.680X2-0.013X3+0.613X4)+e(-1.326-0.002X1+1.400X2-0.088X3+0.331X4)+e(-3.462-0.002X1+1.543X2-0.050X3+0.366X4)128釀酒酵母對乙醇脅迫應激機制的代謝組學研究129130BABAA131ABEFCGHIJABCDEVarID(Primary)132133第七節(jié)合成生物學134合成生物學(Syntheticbiology)是在基因組學、系統(tǒng)生物學和生物信息學等學科的基礎上，于2000年后迅速發(fā)展起來的一門新興學科（McDaniel,2005）。合成生物學依據(jù)自下而上的策略，從最基本的要素開始逐步構(gòu)建生物體的零部件直至人工生命系統(tǒng)（Mark,2009），其核心是按照工程學的思路來設計生物零件，例如啟動子、功能基因、調(diào)控基因等，將其組裝成具有一定生物學功能的基本元件，然后構(gòu)建全新的生物學系統(tǒng)或?qū)ΜF(xiàn)有的生物體進行有目的的改造。什么是合成生物學

——不斷發(fā)展的定義新的生物零件、裝置和系統(tǒng)的設計與建造對現(xiàn)有的、天然的生物系統(tǒng)的重新設計目標：創(chuàng)造可預知的、可再生的、功能明確的生物“機器”有機體，服務人類社會

135136與傳統(tǒng)基因工程的不同——特定的輸入，精確而特定的輸出137什么是合成生物學?傳統(tǒng)生物學通過解剖生命體以研究其內(nèi)在結(jié)構(gòu)，合成生物學從最基本的要素開始將零部件組裝為新的人工生命系統(tǒng)零件（parts）→裝置(device)→系統(tǒng)(system)Parts:promoter、RBS、enhancer、terminatorDevices:signalinput/output,toggleswitch,oscillator,feedbackSystems:1381391.搭建框架：DNA組裝、模塊重排、染色體精簡、人工細胞膜2.安裝固定件：基因整合至染色體3.鋪設管線：通道、支架蛋白4.安裝可移動裝置：轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)錄因子、5.安裝調(diào)控軟件:鋅指蛋白、核糖開關、嵌合受體140合成生物學的使命

科學發(fā)展的必然。生物、物理、化學、計算機、工程等科學發(fā)展到一定階段產(chǎn)生的新學科。合成生物學被認為在化工、制藥、能源、材料、環(huán)保等領域具有廣闊應用前景。2004年合成生物學被美國MIT出版的《技術評論》評為“改變世界的10大新技術之一”，具有巨大的應用開發(fā)潛力,為未來生物技術經(jīng)濟的主要推動力。141文章大都發(fā)表在頂級刊物上142合成生物學的高端文獻WangHH,IsaacsFJ,CarrPA,etal.Programmingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolution.Nature.2009;460,894-8.CullerSJ,etal.ReprogrammingCellularBehaviorwithRNAControllersResponsivetoEndogenousProteins.

Science,2010,1251-1255ToTsz-Leungetal.NoiseCanInduceBimodalityinPositiveTranscriptionalFeedbackLoopsWithoutBistability.Science,2010:1142-1145CalebJ.BashorCJ,etal.UsingEngineeredScaffoldInteractionstoReshapeMAPKinasePathwaySignalingDynamics.Science,2008:1539-1543AriE.FriedlandAE,etal.TimothyK.Lu,XiaoWang,DavidShi,GeorgeChurch,JamesJ.Collins.SyntheticGeneNetworksThatCount.Science

2009:1199-1202NguyenKT,RitzD,GuJ-Q,etal.Combinatorialbiosynthesisofnovelantibioticsrelatedtodaptomycin.Pnas,2006,103,17462-7.143LevskayaA,ChevalierAA,TaborJJ,etal.Syntheticbiology:EngineeringEscherichiacolitoseelight.Nature,2005,438,441-442GardnerTS,CantorCR,CollinsJJ.ConstructionofagenetictoggleswitchinEscherichiacoli.Nature,2000,403,339-342LartigueC,VasheeS,AlgireMA,etal.CreatingBacterialStrainsfromGenomesThatHaveBeenClonedandEngineeredinYeast.Science,2009,325,1693-1696KumaranP,StephanopoulosG.IsoprenoidpathwayoptimizationfortaxolprecursoroverproductioninEscherichiacoli.Science,2010,330(6000):70-74GibsonDG,GlassJI,LartigueC,etal.Creationofabacterialcellcontrolledbyachemicallysynthesizedgenome.

Science,2010,

329:52-56ShanaToppandJustinP.Gallivan.

GuidingBacteriawithSmallMoleculesandRNA.J.Am.Chem.Soc.,2007,129(21),6807–6811ReinkeAW,etal.ASyntheticCoiled-CoilInteractomeProvidesHeterospecificModulesforMolecularEngineering.J.Am.Chem.Soc.,2010,132(17),6025–6031“基因狂人”文特爾（CraigVenter）發(fā)表了他在合成基因組方面的最新結(jié)果。首先合成了蕈狀支原體的基因組。然后成功地將該基因組移植到山羊支原體中（Mycoplasmacapricolum），讓新的基因組取代了宿主原有的基因組144國外研究及應用現(xiàn)狀理論與應用研究并重發(fā)表了許多高水平文章，大多刊登在Nature,Science,Cell,Pnas,PlosBiology,JACS等頂級或一流刊物上基于新思路構(gòu)建基因工程菌，著力解決產(chǎn)量低這一重大科學難題研發(fā)了一批重要生物基化學品，包括C3和C4平臺化合物，生物能源(多元醇、多元酯)，高值醫(yī)藥產(chǎn)品等145國外研究飛速發(fā)展，已經(jīng)設計了多種基因控制模塊，包括開關、脈沖發(fā)生器、振蕩器等，可有效調(diào)節(jié)基因表達、蛋白質(zhì)功能、細胞代謝或細胞間互作。

2003年麻省理工學院成立標準生物部件登記處，供全世界科學家索取，以便在現(xiàn)有零部件基礎上組裝更復雜的生物系統(tǒng)。美國眾議院能源和商務委員會就合成生物學舉行聽證會?？茖W家認為，合成生物學將在清潔燃料、新疫苗及藥品等領域得到廣泛應用。作證專家包括文特爾、加州大學伯克利分校教授杰伊·基斯林等146國外合成生物學領域的活躍分子CraigVentor測序先驅(qū)，基因狂人JayDKeasling的最初專業(yè)不是生物工程DrewEndy,最初是學建筑的TomKnight是搞計算機模擬的GeorgeM.Church人在哈佛醫(yī)學院，從事的不是醫(yī)學研究JamesC.Liao,從事代謝工程及合成生物學147CraigVentor基因狂人——克雷格·文特爾沖浪運動員,越戰(zhàn)老兵,越戰(zhàn)期間服役于美國海軍，曾試圖游入深海自殺，但當游了1英里后，改變了主意。文特爾僅僅是畢業(yè)于社區(qū)大學的本科生，72年獲得生化本科學位，75年獲得加州大學圣迭戈分校的生理和藥學博士學位。CeleraGenomics創(chuàng)始人和前總裁，試圖創(chuàng)建付費的基因數(shù)據(jù)庫，遭到唾罵，激發(fā)了其他研究組加快完成測序并序列發(fā)布為開放獲?。╫penaccess）148上世紀已提出“最小基因組”概念Hutchison,C.A.,Peterson,S.N.,Gill,S.R.,Cline,R.T.,White,O.,Fraser,C.M.,Smith,H.O.andCraig,V.J.(1999)Globaltransposonmutagenesisandaminimalmycoplasmagenome.Science,286,2165-2169.

利用轉(zhuǎn)座子插入突變，篩選突變菌株，從而推斷哪些基因是必須的，哪些基因是可有可無的149Essentialgenes

Glass,J.I.,Assad-Garcia,N.,Alperovich,N.,Yooseph,S.,Lewis,M.R.,Maruf,M.,Hutchison,C.A.,Smith,H.O.andVenter,J.C.(2006)Essentialgenesofaminimalbacterium.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103,425-430.

細胞中并非所有基因都是必須的，通過精簡機構(gòu)，保留維持生命的的最少基因(essentialgenes)，減輕負擔，實現(xiàn)滿負荷工作150JayDKeasling1986獲得化學和生物學學士學位,91年密歇根大學化學工程學博士,斯坦福大學進行博士后。在加州大學伯克利分校，其研究突飛猛進，迅速晉升教授，領導美國第一個“合成生物學”實驗室?；蚋脑煳⑸锷a(chǎn)出青蒿素前體物——青蒿酸DKRo,JDKeasling.

Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast.Nature,2006,440(7086):940-943151JamesC.Liao的工作AtsumiS，HanaiT，LiaoJC．Non-fermentativepathwaysforsynthesisofbranched—chainhigheralcoholsasbiofuels.Nature,2008,451:86-90改造大腸桿菌生產(chǎn)高級醇Expandingmetabolismforbiosynthesisofnonnaturalalcohols

PNAS,

2008;105:20653-20658.非天然醇Directphotosyntheticrecyclingofcarbondioxidetoisobutyraldehyde.NatBiotechnol,2009,27(12):1177-80直接從發(fā)酵液中蒸餾異丁醛

ExpandingmetabolismfortotalbiosynthesisofthenonnaturalaminoacidL-homoalanine.PNAS,

2010;107:6234-6239.非天然氨基酸ProfessorinUniversityofCalifornia,LosAngeles2002年美國醫(yī)學與生物工程研究院院士152國內(nèi)研究現(xiàn)狀(1)起步晚原因之一，理論與實踐脫節(jié)中科院、北大、復旦、中山、中國農(nóng)大等高校和科研院所“重理論，輕應用”，生物工程院?！爸貞?，但理論較弱”，代謝工程、合成生物學的創(chuàng)新思路往往受基礎研究的啟示

例如，麻省理工Alper的全局轉(zhuǎn)錄工程思路基于對RNA聚合酶的深刻認識，并與定向進化技術相耦合，因此文章發(fā)表在Science上，他引次數(shù)極高(2)突出成果不多，方興未艾153(3)引起了國內(nèi)學者的高度重視中國科學院院士張春霆教授說：“合成生物學在認識生命、揭示生命奧秘、重新設計及改造生物等方面具有重大科學意義，代表了下一代的生物技術?！痹⑦M教授認為，我國要緊跟合成生物學科技前沿，在功能模塊的合成與檢測，新生命功能的設計原理，合成基因網(wǎng)絡建模、噪音傳遞、可調(diào)性、穩(wěn)定性分析，系統(tǒng)微調(diào)、進化，生物網(wǎng)絡的解耦、抽提與網(wǎng)絡重構(gòu)，系統(tǒng)新功能集成與優(yōu)化等方面開展研究。154重點實驗室155學術委員會名單

楊勝利院士中科院上海生物工程研究中心鄧子新院士上海交通大學趙國屏院士中科院上海植生生態(tài)所來魯華教授北京大學黃力研究員中科院微生物所劉海燕教授中國科學技術大學吳家睿研究員中科院上海生科院張嗣良教授華東理工大學陳代杰研究員上海醫(yī)工院王磊教授南開大學孫志浩教授江南大學李亦學研究員中科院上海生物信息技術研究中心劉文研究員中科院上海有機所姜衛(wèi)紅研究員中科院上海植生生態(tài)所薛紅衛(wèi)研究員中科院上海植生生態(tài)所1562010年國家啟動了合成生物學重大項目合成生物學可謂先進生物制造157具體研究內(nèi)容構(gòu)建非冗余模式發(fā)酵菌種：自上而下策略up-to-bottom

精簡的大腸桿菌：原核表達平臺精簡的釀酒酵母：真核表達平臺考察指標——細胞分裂快，遺傳穩(wěn)定組裝大宗生物基化學品的合成途徑：

1,3-丙二醇、丁醇、丙烯酸、富馬酸、

3-羥基丙酸、紫杉二烯、青蒿酸、白藜蘆醇等高值天然產(chǎn)物等創(chuàng)制新化合物——基于組合生物合成原理，將酶基因組裝后篩選，創(chuàng)制新能源，目前生物能源局限于脂類和醇類

158科學問題

contemplatingthesyntheticcell基因組越小就越高效嗎？閾值如何如何協(xié)調(diào)多基因共表達，以便降低代謝噪音？如何構(gòu)建“緩沖型堅強菌”，該菌能從容應對環(huán)境變化（搖瓶發(fā)酵→中試→放大），使其產(chǎn)量變化不大，即“任憑風吹雨打，我自閑庭信步”工程菌的群體遺傳學問題159精簡代謝網(wǎng)絡實現(xiàn)基因滿負荷工作重構(gòu)代謝網(wǎng)絡，優(yōu)化酶基因組合合成生物學的意義加速合成生物系統(tǒng)工程化的進程

需要工程化、標準化的策略，將研究人員從日復一日的重復性操作中解脫出來。

驗證和深化對于生物現(xiàn)象的理解“合成”將是“分析”的必要補充。成功固然會幫助我們建立合成生物學的基本原則和生物系統(tǒng)的工程化技術；失敗也是人類的理解與自然生物本質(zhì)間存在鴻溝的直接佐證，并會為我們?nèi)绾胃玫睦斫夂瓦\用源自于自然的技術提供指引。162合成生物學研究內(nèi)容目前合成生物學研究應用主要包括兩個方面，一個方面是“人造生命”，即通過設計和構(gòu)建新的生物零件、組件和系統(tǒng)，創(chuàng)造自然界中尚不存在的人工生命系統(tǒng)。另一個方面是通過對現(xiàn)有的、天然存在的生物系統(tǒng)進行重新設計和改造，修改已存在的生物系統(tǒng)，使該系統(tǒng)增添生物傳感、高效計算、環(huán)境污染監(jiān)測以及藥物與生物基產(chǎn)品的高產(chǎn)等新功能。163合成生物學應用BioEnergy.Cellsarebeingengineeredtoconsumeagriculturalproductsandproduceliquidfuels.BritishPetroleumandtheUSDOEgranted$650milliondollarsforresearchintheSanFranciscoBayArea.DrugProduction.Bacteriaandyeastcanbere-engineeredforthelowcostproductionofdrugs.Examplesincludetheanti-malarialdrugArtemisininandthecholesterol-loweringdrug（降膽固醇藥）.Materials.Recombinantcellshavebeenconstructedthatcanbuildchemicalprecursorsfortheproductionofplasticsandtextiles,suchasBio-PDO（1，3－丙二醇）andspidersilk（蛛絲）.Medicine.Cellsarebeingprogrammedfortherapeuticpurposes.BacteriaandT-cellscanberewiredtocirculateinthebodyandidentifyandtreatdiseasedcellsandtissues.164合成生物學研究舉例“合成生物學”2004年被美國MIT出版的“TechnologyReview”評為將改變世界的10大新出現(xiàn)的技術之一（10EmergingTechnologiesThatWillChangeYourWorld）。短短幾年的實踐已經(jīng)證明該預見的正確性。通過使用自然界提供的簡單模塊，許多合成生物學研究者在進行兩方面的研究：建立有用裝置；研究可以取代自然生物系統(tǒng)的人造生物系統(tǒng)。這些進展主要涉及如下幾方面：（a）合成振蕩器和開關；（b）人造細胞－細胞相互作用系統(tǒng)；（c）工程化的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)；（d）代謝途徑工程；（e）通過蛋白質(zhì)工程制造的新型生物傳感器；（f）最小細胞及合成基因組。這方面的進展已經(jīng)有許多專門的綜述。165（1）美國UCB化學工程系教授、勞倫斯國家實驗室合成生物學中心主任Keasling本科曾獲得化學與生物學雙學位，后來又獲得化學工程博士學位。所以在他從事代謝工程及合成生物學的研究中能很好地將化學、生物學、化學工程學相結(jié)合。

在他從事抗瘧疾藥的生物合成研究中，始終把細胞當作微生物制藥工廠（Microbialdrugfactories），進行設計、加工、集成、組裝、控制。體現(xiàn)在合成生物學技術上包括DNA的合成、來自細菌、酵母及植物（青蒿Artemisiaannua）等多種基因及代謝途徑的組裝、多基因的精密調(diào)控等。他們關于抗瘧疾藥物生物合成的研究成果先后發(fā)表在2003年NatureBiotechnology和2006年的Nature上。合成生物學研究舉例166Keasling實驗室

ResearchInterests:代謝工程，系統(tǒng)生物學，合成生物學SyntheticBiologyforSyntheticChemistryACSChemicalBiology,2008,3:64-76（合成生物學－合成化學－青蒿素合成舉例）ImportanceofsystemsbiologyinengineeringmicrobesforbiofuelproductionCurrentOpinioninBiotechnology2008,19:228–234（系統(tǒng)生物學－生物燃料生產(chǎn)）Metabolicengineeringofmicroorganismsforbiofuelsproduction:frombugstosyntheticbiologytofuels（代謝工程：微生物－合成生物學－生物燃料）

CurrentOpinioninBiotechnology2008,19:inpress

167Theprocessforthemicrobialproductionofartemisinin.Usingsyntheticbiology用合成生物學生產(chǎn)抗瘧疾藥青蒿素168為了盡快使研究成果產(chǎn)業(yè)化，Keasling等人專門建立了新的公司—AmyrisBiotechnologies,用合成生物學技術進行抗瘧疾藥及生物能源的生產(chǎn)。2005年MIT“技術評論”將“細菌工廠”（BacterialFactories）作為將影響世界的新出現(xiàn)的10大技術之一，用大量篇幅以Keasling的工作及AmyrisBiotechnologies公司為例，對細菌工廠進行了介紹。由于在生物合成抗瘧疾藥物的突出成就，Keasling教授被美國“發(fā)現(xiàn)”雜志評選為2006年度最有影響的科學家。該項目已經(jīng)獲得比爾－梅林達蓋茨基金會4300萬美元的資助，進行進一步的實驗室研究、中試、臨床實驗等后續(xù)工作。169170171172ChristinaDSmolke研究組最新論文ProductionofbenzylisoquinolinealkaloidsinSaccharomycescerevisiae

NatureChemicalBiology,2008,4(9):564-573Higher-OrderCellularInformationProcessingwithSyntheticRNADevices

Science,2008,322,456-460Model-guideddesignofligand-regulatedRNAiforprogrammablecontrolofgeneexpression

MolecularSystemsBiology,2008,4;No.224;173ChristinaD.SmolkeDivisionofChemistryandChemicalEngineeringCaliforniaInstituteofTechnologyFoundationaladvancesinRNAengineeringappliedtocontrolofbiosynthesis174ASyntheticGene-MetabolicOscillator

Fung,E.,Wong,W.W.,Suen,J.K.,Bulter,T.,Lee,S.G.andLiao,J.C.(2005)Nature,435,118-122.

wedesignedandconstructedasyntheticcircuitinEscherichiacoliK12,usingglycolyticfluxtogenerateoscillationthroughthesignallingmetaboliteacetylp