分子生物學實驗課考試答案

分子生物學實驗課考核考試題庫1、PCR原理是什么？2、PCR一般體系應加入哪些試劑？3、PCR防止其它DNA污染，應注意哪些問題？4、影響PCR產物產量的因素主要有哪些？5、引物設計應注意哪些問題？6、簡述克隆某一原核生物基因片段一般操作步驟？7、什么是質粒？質粒的基本性質有哪些？8、質粒抽提實驗中溶液I、II、III各有什么作用？9、堿裂解法抽提質粒DNA的基本原理是什么？10、在堿裂解法提取質粒DNA操作中應注意哪些問題？11、在堿裂解法提取質粒DNA時，酚/氯仿的作用是什么？12、堿裂解法提取的質粒DNA分子一般有幾種構象？電泳時移動速率有何差異？13、提取植物基因組DNA的基本原理是什么？在操作過程中應該注意什么？14、在植物基因組提取過程中，DNA降解的可能原因？15、在植物基因組提取過程中，提高DNA產量的措施？16、在使用苯酚進行DNA提取時應該注意什么？17、在提取植物基因組DNA過程中，使用苯酚與氯仿的作用是什么？18、在植物基因組提取過程中，該如何檢測和保證基因組DNA的質量？19、什么是限制性內切酶？20、常見的Ⅱ型限制性內切酶切割雙鏈DNA后會產生末端或末端。21、下列有關限制性內切酶的描述，錯誤的是：（）A．一種限制性內切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列B．限制性內切酶的活性受溫度的影響C．限制性內切酶能識別和切割RNAD．限制性內切酶可以從原核中提取22、現(xiàn)有一長度為l000bp的DNA分子，用限制性核酸內切酶EcoRI酶切后得到的DNA分子仍是l000bp，用KpnI單獨酶切得到400bp和600bp2種長度的DNA分子．用EcoRI，Kpnl同時酶切后得到200bp和600bp2種長度的DNA分子。請畫出該DNA可能的酶切圖譜。23、一個限制性內切酶的識別序列和切割位點是5ˊ一G↓GATCC一3ˊ，在質粒上有該酶的一個切點，請畫出質粒被該限制性內切酶切割后所形成的黏性末端。24、基因工程中，切割目的基因和載體所用的限制酶及切口必備的特點是()A．可用不同的限制性內切酶，露出的黏性末端必須相同B．必須用相同的限制性內切酶，露出的黏性末端可不相同C．必須用相同的限制性內切酶，露出的黏性末端必須相同D．可用不同的限制性內切酶，露出不同的黏性末端25、在遺傳工程技術中，限制性內切酶主要用于（）A.目的基因的提取和導入B.目的基因的導入和檢測C.目的基因與運載體結合和導入D.目的基因的提取和與運載體結合26、在分子生物學實驗中，常使用微量移液器，請說明在使用微量移液器時需要注意什么？27、現(xiàn)有量程為0.1-2.5μl；1-10μl；2.5-20μl；10-200μl；100-1000μl的移液器各一支，請問，當吸取0.15μl，0.5μl，5μl，15μl，100μl，750μl液體時，各需要選取那種最佳量程范圍的移液器？28、本學期我們學習了CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和熱休克法轉化質粒DNA，你還知道哪些方法可以制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和轉化的方法？29、在質粒DNA轉化大腸桿菌時，是如何進行篩選的？30、藍白班篩選的原理是什么？31、在質粒DNA轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞時，如果將用來浸泡玻璃棒的酒精引燃起火該如何處理？32、衛(wèi)星菌落出現(xiàn)的原因是什么？該如何避免？33、影響所制備感受態(tài)效率的因素有哪些？34、轉化后為什么要溫育1小時，為什么加入的是無抗培養(yǎng)基？35、如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？36、在轉化實驗中，實驗組和對照平皿應有什么樣的結果？如何解釋這個結果？37、在學習制備感受態(tài)細胞時，為什么要保證細胞密度<108/ml？甘油的作用是什么？38、通過分子生物學實驗，你認為自己掌握了哪些實驗技能？你對分子生物學實驗有哪些建議與意見？39、用瓊脂糖凝膠分離DNA的理論依據是什么？40、為何在對凝膠進行操作時要帶一次性手套？41、DNA分子在電泳緩沖液中帶正電荷還是負電荷？它在電場中的移動方向如何？電泳中你觀察到哪些現(xiàn)象？42、影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素有哪些？分別有何種影響？43、若有60kb～100kb大小的系列DNA片段要進行分離鑒定，應采取哪種類型的電泳方法才能進行有效分離？為什么？44、在質粒提起實驗中，用溶液III處理后，要進行離心分離。此時，質粒DNA分子在（上清液，沉淀物）中，細菌基因組DNA分子在（上清液，沉淀物）中。45、在質粒提起實驗的最后兩步，要加入2倍體積的乙醇和70%的乙醇溶液。這里不同濃度乙醇的作用是什么？分子實驗考核答案參考1、PCR技術是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它的特異性是由兩個人工合成的引物序列決定。引物就是與待擴增DNA片段兩側互補的寡核苷酸。雙鏈DNA是在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈DNA分子（變性），兩引物分別與兩條DNA的兩側序列特異復性，在適宜條件下，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸，在引物的引導下，按5'→3'方向復制互補DNA，即引物的延伸。在適宜的條件下，這種熱變性→復性→延伸的過程不斷循環(huán)重復，前一個循環(huán)的產物DNA可作為后一個循環(huán)的模板DNA參與DNA合成，使產物DNA的量按2^n方式擴增。

2、10*PCR緩沖液（含Mg+）、模板DNA、四種dNTP、一對引物、耐熱Taq聚合酶3：標本放置時密封要嚴避免溢于容器外，容器要清潔避免造成相互間交叉污染；移液器使用要規(guī)范避免污標本間污染;無菌工作臺操作，避免氣體中有雜菌。

4：引物、酶的種類及濃度、dNTP的質量（優(yōu)劣）與濃度、模板核酸的量與純化程度、Mg2+濃度、溫度與時間、循環(huán)次數5．引物設計應注意的問題：1.引物長度不宜過長20bp左右較佳；2.引物擴增片段的長度以200-500為宜；3.引物堿基的中G+C的含量應在40-60%為宜，G+C太少則擴增效果不佳，G+C過多則易出現(xiàn)非特異條帶；4.避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩天引物間互補，特別是3'端的互補否則會形成二聚體結構；5.引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。6.克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技術對基因進行大量擴增，首先準備好實驗材料大體為：需擴增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR緩沖液、引物等、其過程大體分為3個步驟：第一步：變形：通過加熱使DNA模板雙螺旋鏈解離為單鏈，第二步：退火：當溫度突然降低時。由于模板DNA結構復雜難再互補，而引物建構簡單且數量巨多易于模板DNA互補雜交從而使引物結合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四種底物及鎂離子存在條件下DNA連開始延伸。以上3個步驟為一個循環(huán)，數小時后即可得到大量擴增的目的片段。7，a質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體。b具有復制起點。攜帶易于篩選的選擇標記。具有多種限制性內切酶的切割位點。具有較小的相對分子質量和較高的拷貝數。

8，溶液I:由葡萄糖,EDTA,TrisCl組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質粒DNA;EDTA的作用是絡和掉Mg2+等二價金屬離子,防止DNA酶對質粒分子的降解作用;TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。溶液II:由SDS與NaOH組成.SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性;NaOH(pH>12)的作用是破壞氫鍵,使DNA分子變性。

溶液III:由KAc與HAc組成,是pH值為5.5的高鹽溶液.能中和溶液II的堿性,使染色體DNA復性而發(fā)生纏繞并使質粒DNA復性.K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質形成沉淀而除去.溶液中的染色體DNA也會與蛋白質-SDS形成相互纏繞的大分子物質,很容易與小分子的質粒DNA分離,此外,高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成。9.堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環(huán)狀質粒DNA之間在拓撲學上的差異而達到分離目的。PH介于12.0~12.5時，線性DNA變性，雙鏈打開，而質粒DNA雖變性，但兩條互補鏈彼此纏繞，當PH恢復到中性時，質粒DNA可迅速準確的完成復性，而線性DNA復性較困難，纏繞成網狀，通過離心可沉淀除去。

10.（1）正確使用移液器。（2）溶液ll必須新鮮配制。（3）加入酚-氯仿后必須充分混勻。（4）混勻的過程不能太過劇烈。（5）每次棄上清液時都應用移液器吸去管壁上黏附的水珠。（6）吸取酚-氯仿溶液時要將Tip頭插入液體分層的下側?！究筛鶕谝淮卧囼炞约簩懙淖⒁馐马椷M行補充】11.酚是強烈的蛋白質變性劑，能有效使蛋白質變性而除去，氯仿有強烈的脂溶性，去除脂類雜質，本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質12.超螺旋DNA＞線性DNA＞開環(huán)DNA13.①基本原理:利用液氮對植物組織進行研磨，從而破碎細胞。細胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細胞膜，使蛋白質變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經異丙醇沉淀。②注意事項:⑴材料要新鮮嬌嫩，葉片研磨地越細越好；⑵操作應為無菌操作；⑶操作應溫和，不宜劇烈晃動；⑷注意移液器的正確使用。14.原因:⑴從植物中提取DNA時沒對細胞內的DNA酶進行滅活；⑵操作過程中被細菌污染了；⑶口水等含酶物質飛入樣品中；⑷溫度、PH等變化過于劇烈。15.應當選取幼嫩的葉片，因為幼嫩葉片中的DNA含量高些；組織抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破壞；純化時注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整個實驗過程應該溫和操作，不能劇烈振蕩，混合過程要輕緩，減少抽提，減少DNA片段被認為降解，因為過度振蕩會使DNA斷裂成小片段。16.酚一定要進行堿平衡，苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜、眼睛會對人體造成損傷，應當注意防護；它是出去蛋白質的，要充分振蕩使蛋白質變性，但不能太劇烈而打斷DNA；離心后應該避免再次吸入有機相的苯酚—氯仿，盡量只取上清，不應該讓苯酚最后仍有殘留，需抽提干凈。17.用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保證提取的基因組較純凈。18.檢測：瓊脂糖凝膠電泳；保證DNA活性:用EDTA抑制DNA酶活性，從而保證DNA不被破壞。19限制性內切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶，有三種類型，Ⅰ類，Ⅱ類，Ⅲ類，他們都有甲基化修飾功能和限制酶功能，Ⅱ類常用于分子克隆20.粘性，平21.C22.實驗課見黑板上23,--GGATCC--寫在上面，下面為--CCTAGG--該酶為限制性內切酶I24，A25：D26：1.確定合適的量程，不可超過量程取液。2.取液時按到第一檔，Tip頭垂直進入液面3-5毫米取液。移液器注意不能接觸溶液。3.打出液體時貼壁并有一定角度，要按到第二檔將液體全部壓出。4.使用完畢后，打下tip頭，放好移液器。27.分別是0.1-2.5，0.1-2.5，1-10，2.5-20，10-200，100-1000。

28，氯化銣法，甘油—聚乙二醇法，一步法29題.因為質粒pETBlue-2帶有青霉素抗性基因,所以轉化成功的大腸桿菌細胞能在含羧芐青霉素的瓊脂糖平板上生長形成菌落.所以用含羧芐青霉素的瓊脂糖平板可以篩選出轉化成功的大腸桿菌.30.見實驗指導92面的實驗原理的后半部分!

31.用水打濕的毛巾，著火時用毛巾蓋上就行了32.（1）衛(wèi)星菌落是氨芐降解后生長的雜菌。可能是感受態(tài)細胞的問題也可能是轉化過程出現(xiàn)操作失誤例如未在冰中進行轉化，感受態(tài)在常溫下放置過久失活，轉化后搖菌時間過短，或者搖床速度過慢，沒有把菌搖起來，如果不是轉化過程出現(xiàn)的問題就要進一步考慮連接是否正確，連接時間12~16h，體系一般6ul-10ul，目的片段：載體一般1:3~1:10.（2）可以將培養(yǎng)時間控制在12h-16h之間，或者更換抗生素為羧芐青霉素33：影響因素有（1）大腸桿菌生長狀態(tài)（2）氯化鈣濃度（3）冰上放置時間（4）保存溫度

34題、第一問：溫育就是讓感受態(tài)恢復一下狀態(tài)，以及一些相關抗性基因的表達。畢竟從-70℃環(huán)境中取出，需一段時間適應才可轉化。

第二問：因為細胞比較脆弱，加無抗培養(yǎng)基是為了讓細胞生長，促使在轉化過程中獲得的新表型得到表達。35.（1）操作過程儀器、器皿等不是無菌的，出現(xiàn)了一些雜菌和雜DNA的污染（2）細菌在感受態(tài)時發(fā)生了一些自然變異，對所加的抗生素有一定的抗性，所以長出一些菌落（3）所加的抑菌抗生素濃度不夠，不能夠抑制住細菌的生長（4）一些實驗誤差，錯將菌液放錯36.實驗組中長出菌落而對照組中無任何菌落生長37.細胞生長密度以剛進入對數生長期時為宜，密度過高或不足均會影響轉化效率，一次要保證細胞密度<10^8/ml。甘油的目的是為了防止水在凍結過程中產生過大的冰晶損傷細胞，抑制大腸桿菌生長，以便保存。

38.（主觀題，言之有理即可，例：凝膠電泳，PCR擴增等）39.DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以相同的速率向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。40.瓊脂糖凝膠電泳時戴一次性手套能夠有效阻止EB的滲入．

EB是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套

41、DNA帶負電荷，在電場中向正極移動42.①電壓越大速率越大。②DNA分子量越小速率越大。③DNA的分子結構：超螺旋最快，線型次之，開環(huán)最慢。④介質的種類和濃度。⑤EB⑥電泳緩沖液43，恒定電場強度下的瓊脂糖凝電泳。糖凝膠可以制成不同大小的孔隙度，具有分子篩的效應，所以恒定場的瓊脂糖凝膠電泳適于分離60kb_100kb的DNA片段，DNA片段的遷移率和分子的大小和高級結構有密切關系。44、上清液沉淀物45.無水乙醇的為了是沉淀DNA繼而達到濃縮DNA的目的，70％的乙醇是為了洗滌DNA,進一步除去雜質。建議課時：1-2課時一、實驗目的（1）掌握跨境電商物流渠道分析的流程和方法（2）實操進行跨境電商物流渠道分析二、實驗知識準備（一）國際物流概述國際（地區(qū)間）物流是跨境電商發(fā)展的必備環(huán)節(jié)，其發(fā)展水平高低也成為跨境電商供應鏈融合及跨境電商供應鏈企業(yè)獲得經營效益的關鍵因素?？缇畴娚膛c國際物流相互影響而又緊密聯(lián)系的，跨境電商為國際物流的發(fā)展提供市場機會空間，而國際物流的流暢運轉則是保障跨境電商發(fā)展的必要條件。根據速賣通物流團隊對未來十年的預測，全球貿易形態(tài)會有60%由集裝箱轉為包裹，全球買家不會再介意貨物在世界哪個角落，包裹會在72小時內全球送達。（二）國際物流模式分類跨境電商B2C國際物流模式主要分為以下3種。1、國際快遞國際（地區(qū)間）快遞主要是通過國際（地區(qū)間）商業(yè)快遞公司來解決跨境電商之中商品配送及物流的問題。在國際（地區(qū)間）上知名的國際（地區(qū)間）快遞公司包括UPS、TNT、FedEx、DHL等，其服務時效可通達全世界大部分國家（地區(qū)），但是其價格也相對昂貴；中國郵政速遞也提供國際（地區(qū)間）商業(yè)快遞的服務，其價格優(yōu)于國際（地區(qū)間）知名的四大快遞公司，但其時效會稍差一些。2、國際（地區(qū)間）郵政小包國際（地區(qū)間）郵政小包是服務于跨境電商的一種物流模式，主要通過萬國郵政聯(lián)盟來解決商品配送及物流問題，以個人郵包的形式進行發(fā)貨；而萬國郵政聯(lián)盟是世界郵政國際組織，它是加入其中的成員國處理郵政事務的國際（地區(qū)間）組織，目前其成員國在200個左右。國際（地區(qū)間）郵政小包具有成本低、通關容易等優(yōu)勢，但在實際運營過程中，國際（地區(qū)間）郵政小包的丟包率高、安全性低、時效性不強等劣勢較為突出；同時使用國際（地區(qū)間）郵政小包進行物流運輸，還受制于包裹形狀、體積、重量等因素，在一定程度上影響物流效率及物流體驗。以下以中國郵政小包和e郵寶為例講解。（2）中國郵政國際（地區(qū)間）小包1）中國郵政小包中國郵政小包是中國郵政開展的一項國際（地區(qū)間）郵政小包業(yè)務服務，屬于中國郵政航空小包的范疇，是一項經濟實惠的國際快件服務項目。郵政國際（地區(qū)間）小包主要指是重量在2千克以下，外包裝長寬高之和小于90厘米，且最長邊小于60厘米，通過郵政郵寄到全球各地的一種快遞。2）國際小包國際小包主要分為兩種：普通平郵和掛號。普通平郵費用低，沒有掛號費，不能進行跟蹤查詢服務。掛號可以提供查詢跟蹤服務，價格比普通平郵高一點。3）郵政國際小包的優(yōu)勢介紹：價格優(yōu)勢：資費較低，分服務區(qū)計費，每個區(qū)域按千克價計費。全球化：中國郵政航空小包可以將產品送達全球幾乎任何一個國家（地區(qū)）的客戶手中，只要有郵局的地方都可以到達，擴展了外貿賣家的市場空間。適用范圍廣：速賣通、eBay、敦煌等平臺都可以使用，一般無特別的郵寄限制，除了國際（地區(qū)間）違禁品和危險品以外。（3）國際e郵寶：1）國際e郵寶概述中國郵政為適應國際（地區(qū)間）電子商務寄遞市場的需要，為中國電商賣家量身定制的一款全新經濟型國際（地區(qū)間）郵遞產品。國際e郵寶和香港國際小包服務一樣是針對輕小件物品的空郵產品，目前，該業(yè)務限于為中國電商賣家寄件人提供發(fā)向美國，加拿大，英國，法國和澳大利亞的包裹寄遞服務。2）國際e郵寶優(yōu)勢介紹經濟實惠，支持按總重計費，50克首重，續(xù)重按照每克計算，免收掛號費。時效快，7-10天即可妥投，幫助賣家提高物流得分。專業(yè)，為中國eBay賣家量身定制。服務優(yōu)良，提供包裹跟蹤號，系統(tǒng)與eBay完美對接，一站式操作。3、國際（地區(qū)間）物流專線國際（地區(qū)間）物流專線其特征主要體現(xiàn)在“?！鄙希蚨鴩H（地區(qū)間）物流專線有其專門使用的物流運輸工具、物流線路、物流起點與終點、物流運輸工具、物流運輸周期及時間等，同時它還是根據特定國家或地區(qū)跨境電商物流特點所推出的物流專線；比如現(xiàn)在已開通的中歐班列、俄羅斯專線等。國際（地區(qū)間）物流專線相對與國際（地區(qū)間）郵政小包來說，物流時效更好，但價格比郵政小包更貴一些，其覆蓋面弱于較郵政小包；相對國際（地區(qū)間）商業(yè)快遞，其價格更低，但時效上不如商業(yè)快遞。以上三種物流渠道都可以將包裹寄送到買家手中，其各自有自己的優(yōu)勢和缺點，在跨境電商實際運營過程中，商家可以根據自己的店鋪定位、產品、訂單金額利潤等因素來選擇合適的物流方式。（三）跨境電商通關跨境電商推動了國際貿易的自由化、便利化和業(yè)態(tài)創(chuàng)新，對中國企業(yè)從產品出海到品牌出海，增強綜合競爭力具有重要的意義。但同時也對以傳統(tǒng)外貿為背景制定的交易、支付、物流、通關、退稅、結匯等相關政策提出了新的挑戰(zhàn)。至今，國務院已先后同意在全國設立了105個跨境電子商務綜合試驗區(qū)，在跨境電商技術標準、業(yè)務流程、監(jiān)管模式和信息化建設等方面先行先試。在此背景下，2014年2月10日，海關總署增列了監(jiān)管方式代碼“9610”，獨創(chuàng)“清單核放、匯總申報”通關方式，專門為跨境電商服務，以提升跨境電商企業(yè)通關效率。跨境電商監(jiān)管方式“9610”，適用于境內個人或電子商務企業(yè)通過電子商務交易平臺實現(xiàn)交易，并采用“清單核放、匯總申報”模式辦理通關手續(xù)的電子商務零售進出口商品（通過海關特殊監(jiān)管區(qū)域或保稅監(jiān)管場所一線的電子商務零售進出口商品除外）?！扒鍐魏朔拧奔纯缇畴娚唐髽I(yè)收到訂單后，通過跨境電商外貿綜合服務平臺將訂單、支付單、運單等相關信息報送至海關系統(tǒng)，由海關進行核放出區(qū)。這極大得解決了跨境電商B2C出口訂單批次多、數量少的問題。“清單核放”順利解決了報關時間長、容易出錯等問題，從而讓企業(yè)通關效率更高、降低通關成本?！皡R總申報”是跨境電商企匯總上月結關的清單生成匯總申請單，進入國際貿易單一窗口進行報關，解決了很多繁瑣的線下環(huán)節(jié)。實驗內容1.物流渠道訂單數量分析（1）業(yè)務背景基于跨境電商數據化運營與決策系統(tǒng)進行物流渠道分析，分析各物流渠道占比、各物流渠道對應的top國家、top類目數據，有助于商家更好地制訂物流方案。（2）實訓操作進入跨境電商數據化運營與決策系統(tǒng)，依次單擊“物流分析”“物流渠道分析”，進入物流渠道分析界面。選擇查詢時間，如2020年7月，在查詢結果中，首先可看到各物流渠道的訂單量占比數據，我們可選擇視圖或表格模式。在視圖模式下，觀察各物流渠