生物化學 課件 第12章 基因工程與常用的分子生物學技術

生物化學第十二章基因工程與常用的分子生物學技術目錄第一節(jié)基因工程第二節(jié)常用的分子生物學技術學習目標1．掌握基因工程的概念。2．熟悉基因工程的基本原理和臨床應用；核酸雜交、印跡和PCR技術的原理和臨床應用。3．了解基因診斷、基因治療等新醫(yī)療方法；基因測序和基因芯片技術。第一節(jié)基因工程一、基因工程的概念基因工程（geneticengineering）又稱基因拼接技術或DNA重組技術，即將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法進行改造和重新組合，構建雜種DNA分子，然后導入微生物或真核細胞內，使重組基因在細胞內克隆、表達，產生出人類需要的基因產物，或者改造、創(chuàng)造新特性的生物類型。核心內容：DNA片段的重組和細胞內克隆特點跨物種性基因工程將外源DNA分子進行重新組合且引入到新的寄主生物中進行繁殖，使之具有了跨越天然物種屏障的能力，克服了固有的生物種間限制，擴大和帶來了定向改造生物的可能性，這是基因工程的最大特點。無性擴增少量的外源目的基因在寄主細胞中可大量擴增和高水平表達。二、基因工程的原理和過程（一）基因工程的基本工具限制性核酸內切酶簡稱限制酶，是進行DNA分子剪切的“手術刀”，能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，使較大的DNA分子成為一定大小的DNA片段。二、基因工程的原理和過程（一）基因工程的基本工具DNA連接酶是DNA分子進行拼接的“針線”，恢復被限制酶切開了的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，將DNA片段進行連接、重組。二、基因工程的原理和過程（一）基因工程的基本工具載體載體是重組DNA分子的“運輸車”，需具備下列條件：①能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存；②具有一至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入；③具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇?；蚬こ坛Ｓ玫妮d體有：質粒、噬菌體和動、植物病毒等。（二）基因工程的基本過程完整DNA克隆過程包括五大步驟：①目的DNA的分離獲取（分）；②載體的選擇與準備（選）；③目的DNA與載體的連接（連）；④重組DNA轉入受體細胞（轉）；⑤重組體的篩選及鑒定(篩）。圖12-1以質粒為載體的DNA克隆過程三、基因工程的應用（一）植物基因工程（二）動物基因工程（三）醫(yī)藥基因工程生物化學第十二章基因工程與常用的分子生物學技術目錄第一節(jié)基因工程第二節(jié)常用的分子生物學技術學習目標1．掌握基因工程的概念。2．熟悉基因工程的基本原理和臨床應用；核酸雜交、印跡和PCR技術的原理和臨床應用。3．了解基因診斷、基因治療等新醫(yī)療方法；基因測序和基因芯片技術。第二節(jié)常用的分子生物學技術一、核酸分子雜交和印跡技術核酸分子雜交是指利用DNA復性原理，把不同來源的DNA單鏈或DNA與RNA混合，如單鏈分子間有堿基配對關系，則可特異性地結合形成雜化雙鏈的特性。由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，結合印跡技術和探針技術，可廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。（一）探針技術探針（probe)探針是指用放射性核素、生物素或熒光物質等可檢測標志物標記的已知DNA或RNA片段。它具有特定的序列，能夠與待測的核酸片段依據(jù)堿基互補原理結合，因此可以用于檢測核酸樣品中存在的特定核酸分子。核酸探針根據(jù)其來源和性質可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。利用核酸分子雜交的原理，用特異的基因探針去識別目的基因中特異堿基序列，并與目的基因結合，產生雜交信號，從而進行目的基因檢測的技術稱為探針技術。（二）印跡技術印跡（blotting)將各種生物大分子從凝膠轉移到一種固定基質上的過程，類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此這一技術被稱為“blotting”，譯為印跡技術。DNA印跡技術由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Westernblotting圖12-6DNA、RNA和蛋白質印跡技術示意圖二、PCR技術PCRPCR即聚合酶鏈式反應，是一種利用DNA變性和復性原理在體外進行特定DNA片段高效擴增的化學反應，可以在幾個小時內特異性地將極微量的目的基因DNA片段成百萬倍地擴增放大。該技術于1985年由K.Mullis發(fā)明，具有高敏感、高特異、高產率、可重復、快速簡便等優(yōu)點，給分子生物學研究領域帶來了實驗方法和科學技術上的一場巨大革命，極大地推動了分子生物學以及生物技術產業(yè)的發(fā)展，成為分子生物學與醫(yī)學的支撐技術。Mullis也因此于1993年榮獲諾貝爾化學獎。（一）PCR技術的工作原理（二）幾種常用的PCR衍生技術逆轉錄PCR（RT-PCR）RT-PCR是一種將RNA逆轉錄合成cDNA與PCR技術結合起來、分析基因表達的一種快速靈敏的方法，其原理是以RNA為模板在逆轉錄酶作用下合成互補DNA（complementaryDNA，cDNA），再以cDNA為模板PCR擴增兩段引物之間的目的基因。主要用于對基因表達信息進行檢測或定量分析，還可用于鑒定已轉錄序列是否發(fā)生突變及呈現(xiàn)多態(tài)性，克隆mRNA的5'和3末端序列，從非常少量的mRNA樣品構建大容量的cDNA文庫。（二）幾種常用的PCR衍生技術原位PCR（insituPCR）原位PCR就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，將PCR反應體系滲透到目標組織和細胞中，直接在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。原位PCR不但可以特異性檢測靶DNA，而且還可以進行靶序列的細胞定位或組織定位，更有利于探討靶DNA與細胞之間的關系。該技術自1992年由Nuovo等建立以來，得到迅速發(fā)展，目前已被成功地用于腫瘤發(fā)生學、胚胎學鑒定和定位許多低豐度靶基因，以及病毒、細菌、寄生蟲等的檢測。（二）幾種常用的PCR衍生技術實時定量PCR常規(guī)PCR是在反應終點檢測產物含量，經過多次循環(huán)擴增后的產物堆積將影響對原有模板含量差異的準確判斷。實時定量PCR就是引入熒光標記分子，通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測，計算PCR產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，從而實現(xiàn)對起始模板的準確定量分析，故也被稱為實時熒光定量PCR或熒光定量PCR。定量PCR技術實現(xiàn)了mRNA、miRNA及其他非編碼的