第2章蛋白質(zhì)化學(xué)2012

第二章蛋白質(zhì)

主要內(nèi)容介紹蛋白質(zhì)的構(gòu)件單位氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類、性質(zhì),肽的概念，重點(diǎn)討論蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)和功能的相互關(guān)系。難點(diǎn)與重點(diǎn)：AA的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)Pr的分子結(jié)構(gòu)與功能第一節(jié)蛋白質(zhì)概論第二節(jié)氨基酸**第四節(jié)

蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)**第五節(jié)Pr結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系**第六節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)**

第七節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定第三節(jié)

肽第一節(jié)

蛋白質(zhì)概論

一、

蛋白質(zhì)元素組成與分類

1、

元素組成

碳50%氫7%氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、鉬凱氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.251克氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，稱為蛋白質(zhì)系數(shù)2、分類

球狀蛋白

纖維狀蛋白按蛋白質(zhì)的分子形狀分按化學(xué)組分分單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)按功能分活性蛋白（酶蛋白、受體蛋白……)非活性蛋白（硬蛋白、角蛋白)單純蛋白質(zhì)：僅由a-AA組成的Pr。根據(jù)溶解度不同又分為：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、組蛋白、精蛋白、硬蛋白。結(jié)合蛋白質(zhì)：由AA和輔因子組成。根據(jù)輔基的不同可分為：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅蛋白、黃素蛋白、金屬蛋白。少于50個(gè)AA稱為肽多于50個(gè)AA的稱為蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子量=AA數(shù)目*110二、蛋白質(zhì)分子的大小與分子量催化功能；結(jié)構(gòu)功能；調(diào)節(jié)功能；防御功能；運(yùn)動(dòng)功能；運(yùn)輸功能；信息功能；儲(chǔ)藏功能

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者.三、蛋白質(zhì)功能的多樣性第二節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類*蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)中常見(jiàn)20種氨基酸稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：羥基化的AA、甲基化的AA，是蛋白質(zhì)氨基酸的衍生物，如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質(zhì)氨基酸：不存在于蛋白質(zhì)中，是蛋白質(zhì)常見(jiàn)AA的衍生物，也有D型或一些β-、γ-或δ-AA稀有的蛋白質(zhì)氨基酸.非蛋白質(zhì)氨基酸.蛋白質(zhì)AA的結(jié)構(gòu)通式及特點(diǎn)：1、α-碳原子上均有一個(gè)氨基和一個(gè)羧基。

2、除Pro為α-亞AA外，其余氨基酸均為α-AA。

3、除Gly外，其余氨基酸都有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，有旋光性。

4、除Gly外，其余蛋白質(zhì)AA都是L型AA。CHRCOO-+NH3α二、組成Pr的20中常見(jiàn)AA的結(jié)構(gòu)和符號(hào)20種常見(jiàn)蛋白質(zhì)AA的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號(hào)：按R基團(tuán)極性分類脂肪族AA雜環(huán)AA（HisPro)芳香族AA(PheTyrTrp)按營(yíng)養(yǎng)學(xué)分類必需AA

（8種）非必需AA（12種）按R基團(tuán)極性分類非極性R基團(tuán)AA(8種）極性R基團(tuán)AA不帶電荷（7種）帶電荷負(fù)電荷（2種）

正電荷（3種）AlaValLeuIleProPheTrpMetGlySerThrCysTyrAsnGlnAspGluHisLysArg（12種）注意特殊的AA?。?！從營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度可分為：（1）非必需AA（12種）：可由動(dòng)物和人體自身合成。（2）必需AA（8種）：不能在生物體（動(dòng)物、人體）內(nèi)轉(zhuǎn)化合成，必需由食物供給的氨基酸。ValIleLeuPheMetTrpThrLysArgHis三、氨基酸的兩性解離和等電點(diǎn)

原因：α-羧基pK1在2.0左右，當(dāng)pH>3.5，α-COO以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，當(dāng)pH<8.0時(shí)，α-NH2以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0時(shí)，帶有相反電荷。氨基酸在水溶液中是以兩性離子形式存在

依照酸、堿質(zhì)子理論,酸是質(zhì)子的供體，堿是質(zhì)子的受體。

氨基酸在水中即起酸的作用(供體)

也起堿的作用(質(zhì)子的受體)

在酸性條件下,丙aa以陽(yáng)離子形式存在，可以看作是一個(gè)二元弱酸，有兩個(gè)可以解離的H+，即COOH上的H+和NH3上的H+。它的分解步驟如下:

物質(zhì)的解離常數(shù)是用滴定曲線的實(shí)驗(yàn)方法求得,畫(huà)出曲線。

加入酸堿使丙aa凈電荷等于0時(shí),丙aa所帶正、負(fù)電荷相等,這時(shí)的pH值就是丙aa的等電點(diǎn)。

pI:兩性電解質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等時(shí)溶液的pH值

pI=兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)pK’值之和的一半(2.34+9.69)/2=6.02。中性AA:pI=(pK1+pK2)/2酸性AA:Glu、Asp、pI=(pK1+pKR)/2堿AA:Arg、Lys、His、pI=(pK2+pKR)/2

中性AA的等電點(diǎn)不是pH7，而是小于7，在pH6.0左右，如：Val=5.96，Ala=6.02，Ser=5.68，這是因?yàn)锳A中羧基的解離度大于氨基的解離度。

歸納AA等電點(diǎn)的計(jì)算:谷氨酸（A）和賴氨酸（B）滴定曲線和等電點(diǎn)計(jì)算BApK1pK2pIpIpK3pK3pK2pK1加入的OH-mL數(shù)加入的OH-mL數(shù)一氨基二羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′1+pK′R二氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′2+pK′RHis的咪唑基的pKa值是最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。

pH>pI時(shí)，氨基酸帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。

pH=pI時(shí)，氨基酸凈電荷為零

pH<pI時(shí)，氨基酸帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。

例1：

pH6.0時(shí)將Gly,Ala,Asp,Lys,Arg,Ser混合物點(diǎn)樣于濾紙中央，接上電源進(jìn)行紙電泳。請(qǐng)分析說(shuō)明可能的電泳結(jié)果。分析：

Gly,Ala,Ser的pI為6.0左右，在pH6.0時(shí)凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)；

Asp的pI小于6.0，在pH6.0時(shí)帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)；

Lys,Arg的pI大于6.0，在pH6.0時(shí)帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。

根據(jù)Glu的數(shù)據(jù)（pK1α-COOH2.19，pK2α-N+H39.67，pKRR-COOH4.25，pI3.22）（1）繪出滴定曲線（2）指出Glu-和Glu=各一半時(shí)的pH值（3）指出Glu總是帶正電荷的pH范圍（4）指出Glu±和Glu-能作為緩沖液使用的pH范圍（5）欲配制谷氨酸，最好的緩沖范圍應(yīng)選擇在何處？例2：（1）解：見(jiàn)圖（2）Glu-和Glu=各50%時(shí)pH為9.67（3）pH<3.22時(shí)Glu總帶正電荷（4）Glu±和Glu-緩沖范圍pH4.25左右（5）緩沖能力是指加入酸堿是溶液抗pH的能力。緩沖劑起作用的pH范圍稱為緩沖范圍，通常定義為pKa1。谷氨酸有三個(gè)可解離基團(tuán)，有三個(gè)最佳緩沖范圍，分別是2.21，4.31，9.711、

氨基酸的構(gòu)型與旋光性

Gly一種構(gòu)型,無(wú)旋光性

Thr和Ile有四種光學(xué)異構(gòu)體。其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型。四、

氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收

Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵，在220-300nm近紫外區(qū)有吸收。280nmλ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

Lambert-Beer：2、

氨基酸的光吸收性1、與丹磺酰氯（ＤＮＳ）的反應(yīng)

用以檢測(cè)多肽鏈的Ｎ－末端。DNS＋R-CH-NH2DNS-AA＋HCl

COOH（有熒光）DNS-AA在紫外光激發(fā)后發(fā)黃綠色熒光五、氨基酸的化學(xué)反應(yīng)DNS-Cl可用于多肽鏈—NH2末端氨基酸的標(biāo)記。

Gly—Ala—Ser—Leu—Phe

DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe

水解產(chǎn)物：DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、Phe

DNS-氨基酸被紫外光激發(fā)后發(fā)黃綠色熒光。

氨基酸氨基的一個(gè)H原子可被烴基取代

2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿溶液中與AA反應(yīng)生成2,4-二硝基苯基氨基酸英國(guó)的Sanger用這個(gè)反應(yīng)鑒定多肽N-未端的氨基酸,用以測(cè)定多肽或蛋白質(zhì)的AA排序2、烴基化反應(yīng)

二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸）呈黃色，層析法鑒定。被Sanger用來(lái)測(cè)定多肽的NH2末端氨基酸。Sanger反應(yīng)

現(xiàn)在根據(jù)此原理設(shè)計(jì)出了“蛋白質(zhì)順序測(cè)定儀”Edman反應(yīng)

與苯異硫氰酸酯（PITC）在弱堿條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰（PTC)衍生物,與酸發(fā)生環(huán)化生成PTH-aa,這是著名的Edman降解,進(jìn)行多肽鏈N-未端氨基酸測(cè)定。苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物

3、茚三酮反應(yīng)茚三酮在弱酸性溶液中與a-氨基酸共熱，生成藍(lán)紫色物質(zhì)。脯氨酸或羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物

用于氨基酸定量定性測(cè)定4、成肽反應(yīng)

氨基酸合成肽的反應(yīng)基礎(chǔ)第三節(jié)

肽一、肽和肽鏈的結(jié)構(gòu)和命名

肽：由一AA的羧基和另一AA的氨基脫水縮合而成的化合物。肽鍵：AA之間脫水后形成的共價(jià)鍵，又稱酰胺鍵。AA殘基：指的是肽鏈中的AA單位，不是完整的AA分子。

肽的命名是根據(jù)氨基酸殘基的數(shù)目決定的：

寡肽：十個(gè)以下AA殘基組成的肽。

多肽：超過(guò)10個(gè)AA殘基組成的肽。

多肽鏈：由多個(gè)AA以肽鍵連接的一條鏈。

肽單位：由CO和NH構(gòu)成肽鍵的四個(gè)原子和與之相連的兩個(gè)α-碳原子構(gòu)成的剛性平面或稱酰胺平面。★多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成

γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸

谷胱甘肽（GSH)

非a-羧基,如谷aa、天門(mén)冬aa的中非a-羧基可形成肽鍵。非a-氨基不能形成肽鍵。＃＃＃＃＃＃例如：谷胱甘肽

（1）是一些酶的輔酶。（2）保護(hù)SH基酶。（3）防止過(guò)氧化物的積累。

2G--SHG-S--S-G

還原型氧化型谷胱甘肽的功能：※GS－SG

短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。肽的酸堿性質(zhì)主要取決于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。在多肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。二、肽的酸堿性質(zhì)三、天然存在的活性肽1.谷胱甘肽Glu—Cys—Gly2.短桿菌肽（抗生素）由短桿菌產(chǎn)生的環(huán)10肽，抗菌。3.腦啡肽（5肽，具有鎮(zhèn)痛作用，已發(fā)現(xiàn)幾十種）

Met腦啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—MetLeu腦啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—LeuLeu腦啡肽，既有鎮(zhèn)痛作用又不會(huì)象嗎啡那樣使人上癮。第四節(jié)

蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)Protein的結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸順序）Primary↓

二級(jí)結(jié)構(gòu)Secondary↓

超二級(jí)結(jié)構(gòu)Super↓

構(gòu)象結(jié)構(gòu)域Domain

高級(jí)結(jié)構(gòu)↓三級(jí)結(jié)構(gòu)(球狀結(jié)構(gòu))Tertiary↓

四級(jí)結(jié)構(gòu)(多亞基聚集)Quaternary圖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)

一級(jí)結(jié)構(gòu)：是指蛋白質(zhì)肽鏈中氨基酸的排列順序和連接方式。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)也叫化學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定意義：protein一級(jí)結(jié)構(gòu)(序列)中含有形成高級(jí)結(jié)構(gòu)全部必需的信息，一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。

推斷氨基酸序列（一級(jí)結(jié)構(gòu)）空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)空間結(jié)構(gòu)（高級(jí)結(jié)構(gòu)）功能

（一）protein測(cè)序的基本策略對(duì)于一個(gè)純protein，理想的方法是從N端直接測(cè)至C端，目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。

1.直接法（測(cè)protein的序列）兩種以上特異性裂解法：NCA法裂解

A1

A2

A3

A4B法裂解

B1

B2

B3

B4

2.間接法（測(cè)定核酸序列，推斷氨基酸序列）（二）測(cè)序前的準(zhǔn)備工作

1.protein的純度及均一性鑒定要求：純度97%以上，均一。兩種以上純度鑒定方法才可靠。⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶⑵DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）測(cè)N端氨基酸

2.測(cè)定分子量用于估算氨基酸殘基數(shù)n=M/110方法：SDS凝膠過(guò)濾法、沉降系數(shù)法、滲透壓法（三）測(cè)定步驟

1.

測(cè)定protein分子中多肽鏈的數(shù)目

2.

拆分protein分子中的多肽鏈

3.

斷裂鏈內(nèi)二硫鍵

4.

測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成（6mol/LHCl在110oC水解24h）

5.

分析多肽鏈的N末端和C末端

6.

多肽鏈部分裂解成肽段

7.

測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序

8

.確定肽段在多肽鏈中的順序

9

.確定多肽鏈中二硫鍵的位置將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序

將肽段分離并測(cè)出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y(cè)定二硫鍵拆開(kāi)純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列測(cè)定的基本方法路線確定亞基種類及數(shù)目⑴拆離四級(jí)結(jié)構(gòu)

SDS測(cè)亞基分子量

8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍拆分多肽鏈⑵拆分二硫鍵過(guò)甲酸氧化

—S—S—+HCOOOH→—SO3H

或β巰基乙醇還原

肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化

1.化學(xué)裂解法①溴化氰

—Met—X—

產(chǎn)率85%②亞碘酰基苯甲酸—Trp—X—

產(chǎn)率70-100%③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—2.酶法裂解①胰蛋白酶Lys—X(X≠Pro)，Arg—X

②胰凝乳蛋白酶Tyr—X(X≠Pro)Trp—X，Phe—X③胃蛋白酶

Phe(Trp、Tyr、Leu)—Phe(Trp、Tyr、Leu)A:Ala-PheGly-Lys-Asn-Tyr

His-ValArg-TyrB:Ala-Phe-Gly-LysTyr-His-Val

Asn-Tyr-Arg確定排列:Ala-Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Tyr-His-Val確定整個(gè)肽段的AA序列

一級(jí)結(jié)構(gòu)的書(shū)寫(xiě)方式：

從N末端到C末端，用氨基酸的三字符或單字符連續(xù)排列。例如：牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)

例1：為測(cè)定一個(gè)環(huán)狀多肽的氨基酸序列，用溴化氰進(jìn)行了降解，并對(duì)所得肽段中的一個(gè)進(jìn)行了分析，得到以下數(shù)據(jù)，推斷該肽段氨基酸序列：（1）氨基酸組成分析表明，該肽段含等量以下氨基酸：Ala,Arg,Cys,Glu,Lys,Met,Phe,Pro,Trp;（2）用DNFB試劑反應(yīng)后得到一個(gè)DNP-Pro（3）用胰蛋白酶處理，得到一個(gè)二肽，一個(gè)游離Arg和一個(gè)六肽，該六肽在pH6.4時(shí)顯中性（4）用胰凝乳蛋白酶處理，得到一個(gè)二肽，一個(gè)三肽和一個(gè)四肽；其中二肽在pH6.4時(shí)帶負(fù)電荷；三肽經(jīng)測(cè)定含硫原子，并且其紫外吸收的峰值在280nm處；四肽在pH6.4時(shí)帶兩個(gè)正電荷，無(wú)紫外吸收分析：（1）溴化氰：羧基末端是Met

（2）DNFB：氨基末端是Pro（3）胰蛋白酶:

Arg在Lys之后才有游離的Arg，六肽顯中性說(shuō)明六肽中有一個(gè)堿性氨基酸和一個(gè)酸性氨基酸（4）胰凝乳蛋白酶：二肽中有Glu，三肽中有Cys和Trp，四肽中有Arg,和Lys，無(wú)Phe和TrpPro–Cys-Trp-Glu–Phe-Lys-Arg–Ala-Met例2:

以下數(shù)據(jù)來(lái)自一個(gè)八肽的部分水解分析結(jié)果:已知氨基酸組成為:AlaGly2LysMetSerThrTyr用CNBr斷裂:(1)Ala,Gly,Lys,Thr(2)Gly,Met,Ser,Tyr用胰蛋白酶水解:(1)Ala,Gly(2)Gly,Lys,Met,Ser,Thr,Tyr用胰凝乳蛋白酶水解:(1)Gly,Tyr(2)Ala,Gly,Lys,Met,Ser,ThrN端氨基酸:GlyC端氨基酸:Gly二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈主鏈本身通過(guò)氫鍵按一定方向盤(pán)繞、折疊而形成的構(gòu)象。

（一）構(gòu)型、構(gòu)象

構(gòu)型：指不對(duì)稱碳原子上相連的各原子或取代基團(tuán)的空間排布。如D-構(gòu)型，L-構(gòu)型。構(gòu)型的轉(zhuǎn)變必定伴隨著共價(jià)鍵的斷裂和重組。

構(gòu)象的改變不需要共價(jià)鍵的斷裂，只需要單鍵旋轉(zhuǎn)方向或角度改變即可。

構(gòu)象：指相同構(gòu)型的化合物中，與碳原子相連的原子或取代基團(tuán)在單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)形成的相對(duì)空間排布。實(shí)際上一個(gè)天然的蛋白質(zhì)多肽鏈在一定條件下，只有一種或很少幾種構(gòu)象，而且相當(dāng)穩(wěn)定,這是因?yàn)?

在肽鏈的主鏈中，只有Ca-N1(φ),Ca-C2(ψ)是單鍵,可以自由旋轉(zhuǎn)，所以多肽鏈可以形成特定的構(gòu)象。（2）主鏈上還有側(cè)鏈，其大小及帶電情況不同。它們?cè)趩捂I旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生空間位阻和靜電效應(yīng)，制約著大量構(gòu)象的形成。

（1）主鏈上三分之一是肽鍵，具雙鍵性質(zhì)不能旋轉(zhuǎn)。(β-turn)Ribbonmodelofthebacterialcatabolitegeneactivatorprotein(CAP)無(wú)規(guī)則卷曲（randomcoil）α-螺旋(α-

helix)

β-折疊（β-sheet)β-轉(zhuǎn)角β-turn)

環(huán)(loop)（二）蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的類型

a、肽鏈中的肽平面繞Ca相繼旋轉(zhuǎn)一定角度形成a螺旋。每隔3.6個(gè)氨基酸殘基,螺旋上升一圈;每圈間距0.54nm。1、a-螺旋結(jié)構(gòu)的主要特征如下:b、相鄰螺圈之間形成氫鍵

O·······（氫鍵）·······H-C-（NH-CH-CO）3-N-R(a)理想的右a螺旋。

虛線代表

氫鍵

綠色：C

藍(lán)色：N紅色：O

。此

(b)右a螺旋。(c)左a螺旋。C、二面角Φ=-57°,Ψ=-48°,天然蛋白質(zhì)大部分為右手螺旋

（1）多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸殘基,不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。（2）Gly在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成α—螺旋。

（3）Pro、脯氨酸中止α—螺旋。（4）R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響

典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6個(gè)殘基，13表示氫鍵封閉的環(huán)包括13個(gè)原子。封閉環(huán)原子數(shù)3n+4（n=1、2、）

2.27螺旋（n=1）

310螺旋（n=2）

3.613螺旋（n=3）

4.316螺旋（n=4）

n表示從第一個(gè)酰胺平面開(kāi)始，增加的酰胺平面數(shù)（見(jiàn)下圖）2.27螺旋、310

螺旋、3.613螺旋、4.316螺旋

2、蛋白質(zhì)的β折疊結(jié)構(gòu)

如圖3-11H鍵連接,鋸齒狀的片層結(jié)構(gòu)

a-螺旋β-折疊卷曲的棒狀結(jié)構(gòu)幾乎是完全伸展

的片層結(jié)構(gòu)鏈內(nèi)氫鍵鏈間氫鍵大多數(shù)是右手a-螺旋平行式和反平行式β折疊結(jié)構(gòu)與a-螺旋結(jié)構(gòu)相比有如下特點(diǎn):

O·······（氫鍵）·······H-C-（NH-CH-CO）2-N-Rβ-轉(zhuǎn)角也叫做β-回折,即肽鏈回折180°,使得AA殘基的C=O與第四個(gè)AA殘基的>N-H形成氫鍵。3、β-轉(zhuǎn)角4、無(wú)規(guī)則卷曲:

指沒(méi)有一定規(guī)律的松散結(jié)構(gòu)。作用力弱維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力是？氫鍵三、蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)

超二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈上相鄰的構(gòu)象單元組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)結(jié)構(gòu)組合體。如：a螺旋-β轉(zhuǎn)角-a螺旋，β折疊-a螺旋-β折疊。蛋白質(zhì)超二級(jí)結(jié)構(gòu)纖維狀蛋白質(zhì)（二級(jí)結(jié)構(gòu)）含大量的α-螺旋或β-折疊，占脊椎動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的50%以上，起支架和保護(hù)作用。

1、角蛋白源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚及皮膚的衍生物，可分成α角蛋白和β角蛋白。

α角蛋白（毛發(fā)）主要由α-螺旋組成

β-角蛋白（絲心蛋白）以β-折疊結(jié)構(gòu)為主2.膠原蛋白3.彈性蛋白4.肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白α角蛋白燙發(fā)的化學(xué)機(jī)理還原劑：巰基乙酸半胱氨酸堿性劑：

阿摩尼亞乙醇胺氧化劑：H2O2溴酸鈉

結(jié)構(gòu)域：指在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立、近似球形的組裝體。四、球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域（domain）A.結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位B.較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域C.結(jié)構(gòu)域一般有100－200氨基酸殘基三級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤(pán)旋、折疊，形成的特定的空間結(jié)構(gòu)。1、三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)A、在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的氨基酸殘基在三級(jí)結(jié)構(gòu)上可能相距很近B、球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí)，內(nèi)部是一疏水核C、大的球形蛋白含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)2、維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：包括二硫鍵、鹽鍵、氫鍵、疏水作用力、范德華力氫鍵疏水鍵二硫鍵離子鍵（或鹽鍵）范德華力

鍵能肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠(yuǎn)小于共價(jià)鍵，稱次級(jí)鍵次級(jí)鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因何在?數(shù)量巨大五、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)寡聚蛋白特有的空間結(jié)構(gòu)寡聚蛋白——由數(shù)條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過(guò)次級(jí)鍵疊合而成亞基單獨(dú)沒(méi)有生物功能亞基血紅蛋白1、降低表面積與體積之比，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

2、豐富蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以行使更復(fù)雜的功能。

3、提高基因編碼的效率和經(jīng)濟(jì)性。

4、具有協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)四級(jí)締合在結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)越性一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：同源蛋白細(xì)胞色素c的種屬差異與分子進(jìn)化一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活二、空間結(jié)構(gòu)域功能的關(guān)系：肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的差異蛋白質(zhì)的變性第五節(jié)Pr分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、細(xì)胞色素c的分子進(jìn)化1、細(xì)胞色素c的氨基酸序列的種屬差異和分子進(jìn)化.2、細(xì)胞色素c三級(jí)結(jié)構(gòu)活性部位的保守性.同源蛋白(homologousprotein)：在不同生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。分子進(jìn)化（molecularevolution）：

生物進(jìn)化過(guò)程中，生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸）的演變的過(guò)程。分子進(jìn)化的原則1.在蛋白分子的功能和三維結(jié)構(gòu)保持不變時(shí)，該蛋白質(zhì)的突變替換數(shù)/每位點(diǎn)/每年衡量分子進(jìn)化的速率是大致恒定的。2.功能上較次要的分子或分子的區(qū)域的進(jìn)化速率比功能重要的分子或分子的部分的進(jìn)化快。3.對(duì)現(xiàn)存分子的結(jié)構(gòu)或功能破壞較小的突變替比破壞力較大的突變替換的進(jìn)化來(lái)得頻繁。4.基因復(fù)制總是在獲得一個(gè)新功能之前已發(fā)生。

生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚(yú)21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目根據(jù)細(xì)胞色素C的順序種屬差異而建立起來(lái)的進(jìn)化樹(shù)不同生物來(lái)源的細(xì)胞色素

c

中不變的AA殘基細(xì)胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基35個(gè)不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識(shí)別”并結(jié)合細(xì)胞色素還原酶和氧化酶。二、鐮刀狀貧血病是最早認(rèn)識(shí)的一種分子病分子病：基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)突變而引起的疾病。正常細(xì)胞鐮刀形細(xì)胞正常型

Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lysβ鏈

谷氨酸鐮刀型

Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys

β鏈

纈氨酸Glu（極性）Val（非極性）Hb-Aβ-鏈6GluHb-Sβ-鏈6Val血紅蛋白表面電荷改變,聚集成纖維狀血紅蛋白，使紅細(xì)胞收縮成鐮刀狀，輸氧性能下降，易溶血，嚴(yán)重時(shí)可以致死。三、豬胰島素原激活而形成胰島素示意圖

A鏈B鏈四、肌紅蛋白（Myoglobin）和血紅蛋白（Hemoglobin）的結(jié)構(gòu)與功能

肌紅蛋白（Mb）的結(jié)構(gòu)與功能三級(jí)結(jié)構(gòu)：由一條多肽鏈和一個(gè)血紅素輔基構(gòu)成，含153個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量16700。分子中多肽鏈由8段α-螺旋組成，分子結(jié)構(gòu)致密結(jié)實(shí)，帶親水基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸側(cè)鏈幾乎全埋在分子內(nèi)部。輔基血紅素：由二價(jià)鐵和原卟啉Ⅸ組成，原卟啉Ⅸ由4個(gè)吡咯環(huán)組成，只有亞鐵態(tài)鐵原子的蛋白質(zhì)才能結(jié)合氧。蛋白質(zhì)提供疏水洞穴，固定血紅素基，保護(hù)血紅素鐵免遭氧化，為氧提供一個(gè)結(jié)合部位。結(jié)合氧只發(fā)生暫時(shí)電子重排。

Mb和Hb的輔基—血紅素血紅素(heme)氧合肌紅蛋白中血紅素Fe2+的六個(gè)配體d2sp3血紅蛋白（Hb）結(jié)構(gòu)血紅蛋白由4個(gè)亞基組成，如α2β2（成人血紅蛋白HbA），每個(gè)亞基都有一個(gè)血紅素基和一個(gè)氧結(jié)合部位，α-鏈有141個(gè)殘基，β-鏈有146個(gè)殘基。α鏈、β鏈和Mb的三級(jí)結(jié)構(gòu)都非常相似。實(shí)際上對(duì)于人的這三種多肽鏈分析發(fā)現(xiàn)只有27個(gè)殘基是共有的，這表明蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性。只要功能相同（都與氧結(jié)合），高級(jí)結(jié)構(gòu)就相似，有時(shí)甚至是唯一的。

肌紅蛋白血紅蛋白α血紅蛋白β氨基酸序列大不相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相似（載氧）肌紅蛋白分子和血紅蛋白的組成血紅蛋白的結(jié)構(gòu)模型

氧結(jié)合引起血紅蛋白構(gòu)象變化，氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白在四級(jí)結(jié)構(gòu)上有顯著不同，發(fā)生構(gòu)象變化。氧與血紅蛋白結(jié)合是協(xié)同進(jìn)行的，具有正協(xié)同性同促效應(yīng)，即一個(gè)氧分子與Hb結(jié)合，使同一Hb分子中其余空的氧結(jié)合部位對(duì)氧親和力增加，再結(jié)合第二、三、四個(gè)氧分子則比較容易。

MyoglobinHemoglobinMb和Hb的氧合曲線比較一、蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)、等

電點(diǎn)和電泳

第六節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)1、蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)蛋白質(zhì)分子中除N-端的a-氨基和C-端的a-羧基外，還有許多可解離的側(cè)鏈基團(tuán)，是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下，上述基團(tuán)解離而使蛋白質(zhì)帶電荷。

等電點(diǎn)：在某一pH溶液中，使蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陰極也不向陽(yáng)極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

等電點(diǎn)時(shí)的蛋白質(zhì)：最不穩(wěn)定、溶解度最小、易形成沉淀析出（常用于蛋白質(zhì)的分離純化）；粘度、滲透壓、膨脹性和導(dǎo)電能力均最小。2、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)

電泳：蛋白質(zhì)在溶液中解離成帶電顆粒，在電場(chǎng)中可以向與電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。

在特定PH溶液中所帶電荷不同蛋白質(zhì)分子量不同分子的大小和形狀不同3、電泳

在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度和方向不同用于蛋白質(zhì)的分析、分離、純化、鑒定和制備

單分子蛋白質(zhì)顆粒:直徑1—100nm.

蛋白質(zhì)具有膠體的特征:布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾效應(yīng)以及不能透過(guò)半透膜

穩(wěn)定蛋白質(zhì)的因素：（1）水膜：AA極性基團(tuán),如NH3+、COO-、OH、SH、CONH等易吸附水分子，在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層。（2）電荷：在非等電狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)帶同種電荷相互排斥。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1、鹽析鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等中性鹽,破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，中和他們的電荷，而使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象。即加入高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象

沉淀蛋白質(zhì)的方法有以下幾種:三、蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)

分段鹽析：不同蛋白質(zhì)所帶電荷和親水性不同，析出時(shí)需要的鹽濃度不同，調(diào)節(jié)中性鹽濃度使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出的方法。

2、有機(jī)溶劑沉淀

乙醇、甲醇、丙酮等極性有機(jī)溶劑降低介質(zhì)的介電常數(shù)，破壞蛋白質(zhì)水膜（乙醇等有機(jī)溶劑親水性更強(qiáng)，脫水劑）,使蛋白質(zhì)沉淀。

鹽溶：低濃度中性鹽增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等重金屬離子可與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電荷（pH>pI時(shí)）的基團(tuán)形成不溶性的鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛奶、生蛋清等，防止這些有害離子被吸收。

4、生物堿試劑沉淀生物堿試劑,如苦味酸、單寧酸或三氯乙酸等可與蛋白質(zhì)中帶電荷的基團(tuán)生成不溶性的鹽而析出沉淀。3、重金屬鹽沉淀5、加熱變性沉淀通常不可逆四、Pr的變性與復(fù)性

蛋白質(zhì)變性：受到某些理化因素的影響，（1）分子構(gòu)象發(fā)生變化

（二級(jí)以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)改變)（2）理化性質(zhì)和生物學(xué)功能改變（3）共價(jià)鍵不斷裂（一級(jí)結(jié)構(gòu)不

變，組成成分和分子量不變）

變性的實(shí)質(zhì)：由于外界條件破壞了Pr內(nèi)部的次級(jí)鍵使有序而緊密的結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)序而松散的結(jié)構(gòu)。

引起Pr變性的因素物理因素：加熱、劇烈攪拌，紫外線照射、X射線、超生波化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、生物堿、有機(jī)溶劑等。

復(fù)性：當(dāng)若引起變性的因素較溫和，當(dāng)除去這些因素后，Pr重新自發(fā)折疊恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)象的現(xiàn)象。（1）生物活性喪失，eg.E的催化（2）溶解度降低,粘度增加,擴(kuò)散系數(shù)降低,易凝聚（3）光學(xué)性質(zhì)變化：Pr分子內(nèi)的側(cè)鏈基因暴露到分子表面,從而出現(xiàn)光譜變化（4）生化性質(zhì)改變：易被PrE水解Pr變性后的特征：

（1）大豆Pr溶液加熱加鹽（MgCl2)制成豆腐。（2）分析非Pr成分時(shí)，常用三氯醋酸將樣品中的Pr變性沉淀除去。（3）紫外線照射或人體衰老，Pr變性，親水性漸弱，皮膚失去彈性。（4）酒精中毒、殺菌。Pr變性的應(yīng)用:1、雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng):雙縮脲在堿性溶液中能與CuSO4反應(yīng)生成紅紫色絡(luò)合物的反應(yīng)。一般含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物與CuSO4堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)生成紅紫色絡(luò)合物,是肽和蛋白質(zhì)所特有而AA沒(méi)有的顏色反應(yīng)。用于蛋白質(zhì)或肽的定性和定量測(cè)定。

五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)

蛋白質(zhì)的酪aa酚基能將福林試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物（鉬蘭和鎢蘭的混合物），這一反應(yīng)常用于蛋白質(zhì)微量測(cè)定。3、茚