中文版ISO18593食物和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)-利用接觸板和拭子的表面采樣技術(shù)的水平方式

食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)——使用接觸板和拭子的表面采樣技術(shù)的水平方法范圍本國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了在食品工業(yè)環(huán)境（包括食品加工廠）表面使用接觸板和拭子采樣技術(shù)的水平方法，用于活微生物的檢測(cè)與計(jì)數(shù)。注：“環(huán)境”一詞指與食品接觸的或可以反映污染或再污染來(lái)源的任何物項(xiàng)，如材料、經(jīng)營(yíng)場(chǎng)所和操作者等。規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。ISO6887-1食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)——微生物檢驗(yàn)用試驗(yàn)樣品的初始懸浮液和十倍稀釋液制備——第1部分：初始懸浮液和十倍稀釋液制備通則ISO7218食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)——微生物檢驗(yàn)通則原理鑒于本方法定量不可靠且不具可重復(fù)性，其結(jié)果僅適用于“趨勢(shì)分析”。將一個(gè)裝滿適當(dāng)瓊脂培養(yǎng)基的接觸板（或浸片）壓在待測(cè)表面上，培養(yǎng)后通過(guò)對(duì)成熟菌落計(jì)數(shù)評(píng)估表面污染。采用拭子法時(shí)，首先在待測(cè)表面上標(biāo)記出指定區(qū)域（例如，用樣板標(biāo)記），然后擦拭。將拭子條浸入裝有無(wú)菌稀釋液或中和液的試管或瓶中，并手動(dòng)混合。如果用無(wú)菌（濕）布或海綿擦拭表面，則將采樣裝置儲(chǔ)存在已知體積的稀釋液中（如100cm2的表面用100mL稀釋液）。在實(shí)驗(yàn)中采用初始懸浮液和十倍制稀釋液（必要時(shí)采用）測(cè)定微生物數(shù)量，操作步驟同待測(cè)微生物（群組）計(jì)數(shù)方法。注：待測(cè)微生物類(lèi)型不同，培養(yǎng)時(shí)間和溫度也不同。選擇性培養(yǎng)基可采用適當(dāng)?shù)淖C實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)（證實(shí)的）菌落數(shù)計(jì)算出每平方厘米或每個(gè)拭子上具體微生物集落形成單位的數(shù)目。采樣完成后，對(duì)表面進(jìn)行清洗消毒。如有必要，應(yīng)除去采樣步驟導(dǎo)致的，殘留在采樣表面上的營(yíng)養(yǎng)鹽痕跡。培養(yǎng)基與稀釋液注：詳細(xì)信息請(qǐng)參考待測(cè)或待計(jì)數(shù)目標(biāo)微生物的相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。中和液通常而言，一般采用緩沖過(guò)的蛋白胨水、蛋白胨鹽或其他適當(dāng)稀釋劑（如四分之一濃度的林格氏溶液、pH為的磷酸緩沖液、1g/L的蛋白胨溶液）制作中和液。如果預(yù)計(jì)存在消毒劑殘留，可向稀釋液或接觸板上的培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)闹泻蛣?，以防消毒劑?duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制影響。儀器裝置與玻璃器皿一般要求請(qǐng)參考ISO7218?？捎孟嗨埔?guī)格的一次性?xún)x器替代可再用玻璃器皿。常用微生物實(shí)驗(yàn)室儀器裝置如下：接觸板，直徑65mm的塑料培養(yǎng)皿，裝滿一種體積可控的瓊脂培養(yǎng)基（根據(jù)目標(biāo)微生物選擇），為表面采樣特制。培養(yǎng)皿的直徑或面積隨待采樣表面類(lèi)型而變。瓊脂應(yīng)在培養(yǎng)皿上形成凸起彎月面。注：也可采用能與采樣表面接觸的任何其他裝置（軟質(zhì)或硬質(zhì)容器中的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基），如浸片（）。浸片，合成片（7cm2?10cm2）,一邊或兩邊覆蓋一層固體培養(yǎng)基（根據(jù)目標(biāo)微生物選擇）。注：根據(jù)所尋找的微生物，多種生長(zhǎng)培養(yǎng)基可供使用。拭子，由易碎木條和棉花或合成材料（藻朊酸鹽、人造棉）制成，放置在試管或信封內(nèi)。每個(gè)拭子應(yīng)單獨(dú)包裹消毒，所包材料已證實(shí)不含抑制物質(zhì)。應(yīng)單獨(dú)對(duì)每個(gè)拭子進(jìn)行包裝，消毒。應(yīng)記錄所用材料，材料不含抑制成分。注：采樣后，棉花殘留物會(huì)污染某些類(lèi)型表面的內(nèi)部。潮濕的無(wú)菌布料，不含抗微生物物質(zhì)，分別裝入無(wú)菌塑料袋，適用于大面積采樣（三100cm2）。潮濕的無(wú)菌方形海綿，不含抗微生物物質(zhì)，分別裝入無(wú)菌塑料袋，適用于大面積采樣（三100cm2）。容器，如瓶子、試管或燒瓶等，適用于培養(yǎng)基的消毒和儲(chǔ)存。隔熱的冷藏箱，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室途中用于維持樣品低溫。有刻度的吸量管，寬通道，額定容量為1mL,分刻度為，或移取100口L和1000口L的自動(dòng)吸量管?；旌掀?用于混合培養(yǎng)試管中的液體。蠕動(dòng)均質(zhì)器或水平振動(dòng)均質(zhì)器,配有無(wú)菌塑料袋,蠕動(dòng)（蠕動(dòng)均質(zhì)器）或振動(dòng)（水平振動(dòng)均質(zhì)器）制備初始懸浮液。培養(yǎng)皿，由塑料制成，直徑為65mm。pH計(jì)，25℃±1℃下精度為pH單位，測(cè)量準(zhǔn)確度為±pH單位。樣板，由耐蝕材料制成（如封閉面積為20cm2?100cm2的不銹鋼框架），易清潔，可消毒。采樣技術(shù)綜述實(shí)驗(yàn)室收到的樣品應(yīng)為待測(cè)表面的代表性樣品，在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中未發(fā)生變化，或消毒劑殘留亦未導(dǎo)致樣品發(fā)生變化。所配消毒劑殺菌持續(xù)時(shí)間為5min?15m也。按照消毒劑規(guī)范，在用拭子或接觸板檢驗(yàn)表面之前等待一段時(shí)間，以評(píng)估清洗和消毒過(guò)程的性能（或根據(jù)消毒規(guī)范）。無(wú)法為所有情況指定一種適當(dāng)?shù)闹泻蛣?，通常采用山梨醇酐單油酸酯?0g/L）和卵磷酯（3g/L）中和被樣品吸收的消毒劑殘留物（如季銨鹽化合物、amphotericides）。硫代硫酸鈉（5g/L）是鹵基類(lèi)消毒劑的良好中和劑。過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶可作為過(guò)氧化基類(lèi)消毒劑的中和劑。在25℃和pH二土條件下，單位酶催化作用下每分鐘可分解1umol過(guò)氧化氫。EN1276[1]、EN1650[2]、EN13697[3]和EN13704[4]中介紹了許多消毒劑的中和劑。表1中列出了多數(shù)情形下可用的中和劑的成分。在蛋白胨（1g/L）溶液和氯化鈉（L）溶液中制備，然后移入試管或瓶中，消毒15min（121℃）。表1大多數(shù)情況下可用的中和劑組成 濃度山梨醇酐單油酸酯（聚山梨醇酯80）30g/LTOC\o"1-5"\h\z卵磷酯 3g/L硫代硫酸鈉 5g/LL-組氨酸 1g/L皂甙 30g/L接觸板法從運(yùn)輸容器中取出樣品后，將接觸板或浸片緊壓在瓊脂表面，避免與試驗(yàn)表面發(fā)生任何側(cè)邊接觸。由相關(guān)文獻(xiàn)可知，接觸板法最優(yōu)結(jié)果對(duì)應(yīng)條件為10s的接觸時(shí)間和500g質(zhì)量產(chǎn)生的壓力。接種完畢后立即封閉接觸板或拭子，并放回運(yùn)輸容器。拭子法或布/海綿法拭子法從無(wú)菌包裝中取出一個(gè)拭子，將拭子一端浸入裝有稀釋液的試管中。將拭子尖端壓靠在管壁上以除去過(guò)量水分。用拭子尖端接觸待檢測(cè)表面，劃出大約20cm2?100cm2的面積，沿著互成直角的兩個(gè)方向在拇指與食指間轉(zhuǎn)動(dòng)拭子。將拭子放入裝有稀釋液的試管中，在不感染細(xì)菌的情況下折斷或切斷拭子棒。布/海綿法打開(kāi)裝有布或海綿的塑料袋或容器。用消毒鉗或戴上消毒手套移走布或海綿，無(wú)菌操作。用適量（不可過(guò)量）稀釋液潤(rùn)濕布或海綿。測(cè)定濕潤(rùn)表面時(shí)可省略此步驟。將布或海綿放回運(yùn)輸容器，封閉，避免發(fā)生泄漏。在選定表面上從兩個(gè)互成直角的方向上取樣，同時(shí)變換布或海綿的面。將布或海綿置于無(wú)菌容器中，加入稀釋液后封閉。加入已知體積的適量稀釋液，確保分析時(shí)布或海綿仍處于潤(rùn)濕狀態(tài)?；蛘撸蜷_(kāi)裝有布或海綿的塑料袋。通過(guò)袋子握住海綿，將翻轉(zhuǎn)的袋子蓋在手上。按上述方法用海綿收集樣品，然后將布或海綿移入無(wú)菌塑料袋中，封閉，避免發(fā)生泄漏。運(yùn)輸將拭子法采取的樣品置于1℃~4℃的冷藏箱中，4h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室為宜。根據(jù)第八條規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室接收樣品后應(yīng)在24h內(nèi)檢驗(yàn)送檢樣品。將接觸板和/或浸條在4h運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸途中不得發(fā)生污染。方法接觸板法按照待計(jì)數(shù)微生物類(lèi)型培養(yǎng)接觸板或浸條（參考第四條的注釋?zhuān)＝佑|板法不適用于致病微生物的特殊檢測(cè)。拭子法（包括布和海綿法）用混合器（）充分混合內(nèi)含拭子的管內(nèi)溶液30s，調(diào)節(jié)混合速度以確保管口下2cm?3cm處管壁潤(rùn)濕。根據(jù)待測(cè)面積的大?。ㄈ?00cm2的表面用100mL溶液），向盛有布或海綿的塑料袋中加入適量稀釋液或中和液（）。用蠕動(dòng)均質(zhì)器（）處理袋中溶液1min，或用水平振動(dòng)均質(zhì)器（）處理30s。即為初始懸浮液。如果預(yù)計(jì)微生物數(shù)目較多，可用蛋白胨水配制十倍稀釋液，稀釋至菌落數(shù)目可數(shù)為宜（參考ISO6887-1）。根據(jù)所用計(jì)數(shù)方法（參考適用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)），用初始懸浮液接種兩個(gè)重復(fù)的培養(yǎng)基，傾注平板法用1mL接種液，平板涂布法用接種液。以同樣方式處理其他任何稀釋液。倒置培養(yǎng)皿，在適宜溫度下，適當(dāng)培養(yǎng)每種培養(yǎng)基。滴液平板法可以用作上述平板培養(yǎng)法的替代方法。從最濃稀釋液開(kāi)始，用無(wú)菌吸量管依此吸取整數(shù)倍體積的初始懸浮液（拭子、布或海綿）和稀釋液，移至瓊脂板底部標(biāo)記的培養(yǎng)基適當(dāng)分區(qū)上（平行移取兩次，即兩個(gè)不同瓊脂板使用同一稀釋液）。每個(gè)預(yù)烘干的瓊脂板上最多容納6種不同稀釋液的滴液。移取整數(shù)倍體積溶液時(shí)壓制住活塞，采用反向移液技術(shù)移取溶液，只在第一停點(diǎn)時(shí)壓制活塞，從而進(jìn)行接種。保持瓊脂板處于水平方向（頂部加蓋），直到表面干燥。如果拭子用于證明存在特殊微生物（如單核細(xì)胞增多性李斯特菌或沙門(mén)氏菌），則檢測(cè)面積至少為100cm2,最好在1000cm2左右。將拭子、布或海綿轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)母患后w培養(yǎng)基上，混勻。菌落計(jì)數(shù)與檢測(cè)接觸板法到規(guī)定培養(yǎng)期后，直接數(shù)出接觸板或浸片上的典型菌落數(shù)目。如有必要，可按照需檢測(cè)的微生物進(jìn)行確認(rèn)。拭子法（包括布和海綿法）對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，如有必要，可按照需檢測(cè)的微生物進(jìn)行確認(rèn)。滴液平板法數(shù)出生成5~50個(gè)菌落的稀釋液中的目標(biāo)菌落數(shù)目。富集步驟經(jīng)過(guò)預(yù)富集后，根據(jù)須檢測(cè)的微生物按照說(shuō)明進(jìn)行。結(jié)果表達(dá)與計(jì)算警告——接觸板法與拭子/布法通常不會(huì)得出相同結(jié)果，因此必須在報(bào)告中注明所用方法。接觸板法接觸板表面積除以典型菌落數(shù)量。得出的計(jì)數(shù)為每平方厘米表面上的集落形成單位（CFU）數(shù)目。拭子法（包括布和海綿法）按照相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每毫升初始懸浮液中的CFU數(shù)目。按下列公式計(jì)算每平方厘米研究表面上的CFU數(shù)目Ns：其中，N—1mL稀釋液或中和液中的CFU數(shù)目；F一試管或均質(zhì)袋中的稀釋液（或中和液）體積，以毫升計(jì)；A一所研究表面的面積，以平方厘米計(jì)；D一所用稀釋度的倒數(shù)。滴液平板法中，按下列公式計(jì)算每毫升懸浮液中的CFU數(shù)目N：其中，—從兩個(gè)連續(xù)稀釋液上保留的所有滴液中數(shù)出的菌落總數(shù)，至少有一個(gè)稀釋液中含有5個(gè)菌落；V—每滴所用接種液的體積（此處為50口L）；n1—第一稀釋液中保留的滴數(shù)；n2一第二稀釋液中保留的滴數(shù);d一保留的第一稀釋液所對(duì)應(yīng)的稀釋因子。按下列公式計(jì)算每平方