常規(guī)體外受精中國專家共識(shí)(2024年)

常規(guī)體外受精中國專家共識(shí)（2024年）前言常規(guī)體外受精（conventionalinvitrofertilization，c-IVF）是人類輔助生殖技術(shù)（assistedreproductivetechnology，ART）中被廣泛應(yīng)用的授精方式之一，其主要是針對(duì)女性因素（如輸卵管性不孕、子宮內(nèi)膜異位癥、排卵異常及宮頸因素等）、部分男性因素（如輕、中度少弱畸形精子癥）及不明原因不孕不育（卵巢功能評(píng)估、輸卵管通暢度評(píng)估及男性精液分析均正常）患者所采取的治療方案。相較于卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）技術(shù)而言，c-IVF的精卵結(jié)合方式更接近人類生理狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室操作也相對(duì)簡(jiǎn)單。前言然而在精液參數(shù)正常的情況下，c-IVF仍然有20%左右的取卵周期發(fā)生受精率低下（lowfertilizationrate，LFR，<25%）及5%~15%的取卵周期發(fā)生完全受精失?。╰otalfertilizationfailure，TFF）。目前尚缺乏c-IVF的操作標(biāo)準(zhǔn)或共識(shí)，尤其對(duì)于精液參數(shù)處于臨界值的病例，授精方式的選擇多根據(jù)臨床醫(yī)生和胚胎實(shí)驗(yàn)室人員的經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合患者病史決定，雖然做到了個(gè)性化處理，但由于缺乏有力數(shù)據(jù)的支持，無法避免發(fā)生LFR和TFF的風(fēng)險(xiǎn)。部分中心為了避免受精失敗的發(fā)生，則會(huì)選擇對(duì)全部或部分卵母細(xì)胞行ICSI技術(shù)授精，無形中導(dǎo)致了ICSI技術(shù)的過度應(yīng)用。前言本共識(shí)根據(jù)國內(nèi)外發(fā)表的文獻(xiàn)，并結(jié)合長期實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過專家討論制定而成。通過對(duì)c-IVF選擇標(biāo)準(zhǔn)、精液的優(yōu)化處理、授精操作、授精時(shí)機(jī)的選擇、短時(shí)受精及早期受精判斷、受精失敗的補(bǔ)救措施、受精觀察、其在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantationgenetictesting，PGT）與無創(chuàng)胚胎染色體篩查（non-invasivechromosomescreening，NICS）的應(yīng)用、質(zhì)量控制及胚胎實(shí)驗(yàn)室新員工培訓(xùn)與考核等多方面進(jìn)行詳細(xì)闡述，并提出相應(yīng)推薦意見，以期為輔助生殖臨床醫(yī)生和胚胎實(shí)驗(yàn)室人員提供實(shí)際可行的建議和指導(dǎo)。c-IVF的精液標(biāo)準(zhǔn)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（第六版）》（WHO手冊(cè)第六版）提出的正常男性精液質(zhì)量下限參考標(biāo)準(zhǔn)（第五百分位值）：精子總量為39×106、精子濃度為16×106/mL、前向運(yùn)動(dòng)精子率為30%、正常形態(tài)精子率為4%，但該下限標(biāo)準(zhǔn)對(duì)ART治療中是否可以選擇c-IVF缺乏指導(dǎo)意義。因此，仍需制定一個(gè)可以選擇c-IVF授精方式的精液質(zhì)量下限標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于少、弱精子癥患者（精子濃度<20×106/mL和/或精子活動(dòng)率<40%，WHO手冊(cè)第四版）授精方式選擇的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究中，將106個(gè)取卵周期的1518枚卵母細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分配，行c-IVF（669枚）或ICSI（849枚），結(jié)果表明ICSI組受精率（50%）高于c-IVF組（41%），且c-IVF組發(fā)生TFF的風(fēng)險(xiǎn)要明顯高于ICSI組；c-IVF的精液標(biāo)準(zhǔn)另一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究分別對(duì)少精子癥組[精子濃度（5~20）×106/mL，WHO手冊(cè)第四版]與少弱精子癥組[精子濃度（5~20）×106/mL且前向運(yùn)動(dòng)精子10%~32%，WHO手冊(cè)第四版]的卵母細(xì)胞行c-IVF或ICSI，結(jié)果表明兩組不同授精方式間的受精率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但目前尚缺乏基于最新版WHO手冊(cè)少弱精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)研究。鑒于ART治療所使用的精子通常是經(jīng)密度梯度離心或上游后所獲得的活力較高的精子，因此將處理后的精子參數(shù)作為受精結(jié)果的預(yù)測(cè)指標(biāo)更為合適。c-IVF的精液標(biāo)準(zhǔn)一項(xiàng)回顧性研究顯示，當(dāng)處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)（totalprogressivelymotilespermcellcount，TPMC）<1.1×106時(shí)發(fā)生TFF的風(fēng)險(xiǎn)>25%。另一項(xiàng)對(duì)112個(gè)同時(shí)行c-IVF和ICSI周期的回顧性研究顯示，ICSI受精而c-IVF未受精周期的處理后活動(dòng)精子總數(shù)[（1.06±0.9）×106]顯著低于c-IVF與ICSI均受精周期的處理后活動(dòng)精子總數(shù)[（4.4±3.4）×106]，表明優(yōu)化處理后的活動(dòng)精子總數(shù)為較好的預(yù)測(cè)受精失敗的指標(biāo)；該研究將處理后活動(dòng)精子總數(shù)<1.5×106作為臨界指標(biāo)，結(jié)果顯示其對(duì)c-IVF受精失敗的預(yù)測(cè)靈敏度為80%。聶玉林等的一項(xiàng)回顧性研究表明，上游后前向運(yùn)動(dòng)精子回收率≤5%和TPMC<1.0×106，是影響受精率的高危因素。c-IVF的精液標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)畸形精子癥的最佳授精方式選擇同樣存在爭(zhēng)議。一項(xiàng)薈萃分析表明：雖然單純畸形精子癥行c-IVF可能影響受精率，但與其行ICSI或與正常精子形態(tài)行c-IVF的妊娠結(jié)局相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。近期的一項(xiàng)回顧性研究對(duì)畸形精子癥做了進(jìn)一步區(qū)分，結(jié)果表明，當(dāng)96%<精子畸形率≤98%時(shí)，c-IVF組與ICSI組的受精率、卵裂率、人絨毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin，hCG）陽性率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)精子畸形率>98%時(shí)，c-IVF組卵裂率、hCG陽性率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著低于ICSI組。但對(duì)于特殊類型的畸形精子癥，如圓頭精子癥、無頭精子癥、大頭精子癥、精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常等，采用c-IVF不能實(shí)現(xiàn)正常受精。該類精子畸形可能具有遺傳性，需根據(jù)精子缺陷類型選擇個(gè)體化的ART助孕。c-IVF的精液標(biāo)準(zhǔn)推薦意見1：①對(duì)于精子濃度、活力均正常的樣本可以采用短時(shí)或過夜c-IVF的方式。②對(duì)于精子濃度、活力處于臨界值的樣本，尤其精液優(yōu)化處理后TPMC<1.5×106，建議采用短時(shí)受精結(jié)合早期脫顆粒的方式。③當(dāng)精液優(yōu)化處理后TPMC<1.0×106，尤其獲卵數(shù)較多時(shí)，可在簽署知情同意的情況下對(duì)部分或全部卵母細(xì)胞行ICSI技術(shù)以保障正常受精。④目前尚無有力證據(jù)表明單純畸形精子癥對(duì)c-IVF的受精率及妊娠結(jié)局產(chǎn)生不利影響，但對(duì)于特殊類型的畸形精子癥患者（如圓頭精子癥、無頭精子癥、大頭精子癥、精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常等），則需要根據(jù)精子缺陷的種類及其致病基因，選擇ICSI或供精治療。精液質(zhì)量參數(shù)與推薦授精方式詳見表1。c-IVF的精液標(biāo)準(zhǔn)精液優(yōu)化處理ART治療中精液優(yōu)化處理的主要目的是最大限度地提高優(yōu)質(zhì)精子濃度，減少非前向運(yùn)動(dòng)精子、不動(dòng)精子、形態(tài)異常精子、未成熟的生精細(xì)胞和白細(xì)胞，以及去除精漿中抑制精子獲能的因子、細(xì)胞碎片和其他可能產(chǎn)生負(fù)面影響的有害物質(zhì)（如活性氧、微生物或?qū)е伦訉m收縮的化合物等），但目前尚無一種方法可以滿足上述所有要求，因此可以根據(jù)不同精液質(zhì)量，選擇合適的精液優(yōu)化處理方法。臨床上常用的精子制備技術(shù)有上游法（swim-up，SU）和密度梯度離心法（densitygradientcentrifugation，DGC）。精液優(yōu)化處理關(guān)于兩種方法進(jìn)行精液優(yōu)化處理的效果比較，多數(shù)是通過處理后的精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)、正常形態(tài)、精子DNA碎片比例、線粒體膜電位及活性氧水平等方面進(jìn)行對(duì)比，但兩種處理方法的優(yōu)劣尚無一致的結(jié)論。多項(xiàng)研究表明，DGC法較SU法具有更高的精子回收率（分別為>20%和<20%），而SU法可以獲得更高的前向運(yùn)動(dòng)精子比例。一項(xiàng)回顧性研究分析了719個(gè)經(jīng)DGC處理和719個(gè)經(jīng)SU處理的c-IVF/ICSI周期治療結(jié)局，結(jié)果顯示累積活產(chǎn)率、每移植周期活產(chǎn)率以及其他臨床和胚胎實(shí)驗(yàn)室結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精液優(yōu)化處理也有學(xué)者認(rèn)為，DGC聯(lián)合SU應(yīng)用效果較優(yōu)，與單獨(dú)SU相比，聯(lián)合應(yīng)用可提高正常形態(tài)精子獲得率；與單獨(dú)DGC相比，聯(lián)合應(yīng)用可有效減少超微結(jié)構(gòu)異常精子比例、降低精子DNA碎片率和核不成熟比例。另外，值得注意的是DGC相對(duì)SU更容易做到標(biāo)準(zhǔn)化，相對(duì)便于胚胎實(shí)驗(yàn)室精液處理的質(zhì)量控制。近些年，微流控技術(shù)也開始應(yīng)用于ART的精液優(yōu)化處理，其模擬精子在女性生殖道中經(jīng)過生理性篩選的過程，具有分選高效、操作簡(jiǎn)便快捷、對(duì)精子DNA損傷少等優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)精液優(yōu)化處理方法相比較，微流控技術(shù)是否能改善生殖結(jié)局，仍需更多的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。精液優(yōu)化處理推薦意見2：①鑒于目前尚無充分證據(jù)證實(shí)DGC和SU對(duì)c-IVF治療結(jié)局有差異，因此單獨(dú)使用或者兩種方法聯(lián)合使用均可作為c-IVF精液優(yōu)化處理的常用技術(shù)。②對(duì)于精液參數(shù)正常的樣本，可優(yōu)先使用SU法。③而對(duì)精子濃度較低的樣本，或精子濃度較高但活力較低、供精、精液內(nèi)伴有大量圓形細(xì)胞、精子凝集程度較高的樣本，或男方存在感染因素的樣本，建議使用DGC法或DGC聯(lián)合SU法進(jìn)行精液的優(yōu)化處理。授精操作及調(diào)整授精濃度每個(gè)ART胚胎實(shí)驗(yàn)室均有符合本實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范的授精操作方式及授精器皿，目前尚無統(tǒng)一的要求或規(guī)范。常用受精皿包括：圓形皿（微滴法）、中央孔皿（雙井皿）、四孔板等。不同受精皿對(duì)應(yīng)的受精液體積也有所不同，中央孔皿或四孔板通常為0.5~1.0mL，微滴法通常為30~100μL。加精的方式常見以下3種：①將精子調(diào)整至合適濃度，通過計(jì)算吸取合適體積的精子懸液，加入含有卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocytecomplexes，COCs）的培養(yǎng)液中，此法適用于使用中央孔皿或四孔板受精；②根據(jù)受精液體積，加入適當(dāng)濃度精子，然后再加入COCs，此法多用于微滴法受精；③用預(yù)平衡的受精液將精子稀釋至合適濃度，然后制成微滴或加入中央孔皿或四孔板中，再加入COCs。為防止培養(yǎng)液pH值和溫度發(fā)生改變，建議平衡時(shí)間至少1h。授精操作及調(diào)整授精濃度盡管受精過程中精子的濃度范圍較寬，但所獲得的總受精率卻相近。而有研究顯示，隨著精子濃度的增加，多精受精的比例逐漸上升，臨床妊娠率逐漸下降。因此，在保障穩(wěn)定受精率的前提下，精子濃度應(yīng)盡量控制在較低的范圍。推薦意見3：①目前尚無有力證據(jù)表明不同的受精皿、受精液體積及加精方式對(duì)c-IVF結(jié)局有影響，因此各中心可根據(jù)操作習(xí)慣和工作流程進(jìn)行選擇。授精操作及調(diào)整授精濃度②本共識(shí)建議授精濃度為30~50μL的液滴內(nèi)加前向運(yùn)動(dòng)精子5000~10000條，或1mL的培養(yǎng)液內(nèi)加前向運(yùn)動(dòng)精子10萬~30萬條。③是否對(duì)COCs卵丘細(xì)胞進(jìn)行切割目前尚無統(tǒng)一規(guī)范，但建議盡量將血塊切割去除，避免將紅細(xì)胞帶入卵母細(xì)胞孵育液或受精液中。④胚胎實(shí)驗(yàn)室宜結(jié)合自身?xiàng)l件與特點(diǎn)進(jìn)行具體方法改良，比如可進(jìn)一步根據(jù)精子在鏡下的活力情況、卵母細(xì)胞數(shù)量、卵丘成熟度、過夜受精或短時(shí)受精方式，靈活調(diào)整精子添加濃度，形成符合自身?xiàng)l件的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。授精時(shí)機(jī)促排卵周期中卵母細(xì)胞會(huì)存在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)發(fā)育不同步的情況，因此理論上對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間的體外孵育有利于細(xì)胞質(zhì)的進(jìn)一步成熟，從而提高受精率和臨床妊娠率。幾十年來關(guān)于卵母細(xì)胞授精前孵育時(shí)間的相關(guān)研究較多，但最佳孵育時(shí)間卻較為寬泛且觀點(diǎn)并不一致，詳見表2。近期一項(xiàng)納入了9575個(gè)周期的大型回顧性研究顯示，不同的孵育時(shí)間對(duì)c-IVF卵母細(xì)胞受精能力的影響不同（<1.5h受精率顯著降低，而受精率提高可能增加累積妊娠率），而胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局卻無明顯差異。因此該研究認(rèn)為，體外孵育時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能無顯著影響，可根據(jù)胚胎實(shí)驗(yàn)室的工作流程在一定時(shí)間范圍內(nèi)（孵育1.5~6.5h）安排授精時(shí)機(jī)。授精時(shí)機(jī)授精時(shí)機(jī)另外，適當(dāng)延長扳機(jī)至取卵的間隔時(shí)間（36~38h）同樣有助于卵母細(xì)胞胞質(zhì)的進(jìn)一步成熟（體內(nèi)成熟），從而改善臨床結(jié)局，因此授精時(shí)機(jī)的選擇應(yīng)結(jié)合扳機(jī)時(shí)間來決定。也有學(xué)者在授精前將COCs置于體外成熟培養(yǎng)液中孵育，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)胞質(zhì)的成熟并提高囊胚形成率。推薦意見4：鑒于各中心促排卵方案、扳機(jī)時(shí)間、取卵時(shí)機(jī)及患者個(gè)體間的差異，導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞（MⅡ）比例有所不同或卵母細(xì)胞間胞質(zhì)成熟度不一致，因此授精時(shí)機(jī)的選擇應(yīng)綜合考量后合理安排時(shí)間節(jié)點(diǎn)。本共識(shí)建議根據(jù)取卵后COCs的狀態(tài)選擇個(gè)體化的孵育時(shí)間，正常情況下建議在扳機(jī)后38~40h內(nèi)完成授精。短時(shí)受精短時(shí)受精是將精卵共孵育的時(shí)間由過夜受精的16~24h縮短至1~6h的一種c-IVF衍生技術(shù)。有研究顯示，精子產(chǎn)生的活性氧可促進(jìn)卵丘細(xì)胞的凋亡，且卵母細(xì)胞長期暴露在高濃度的精子中可能會(huì)對(duì)早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。另外Li等的研究顯示，過夜受精組受精液中的銨離子濃度顯著高于短時(shí)受精組，縮短受精時(shí)間可以顯著降低早產(chǎn)率。早期的薈萃分析顯示，縮短精卵共孵育的時(shí)間會(huì)增加臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及種植率。但也有研究提示，盡管短時(shí)受精比過夜受精在提高優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和持續(xù)妊娠率方面具有優(yōu)勢(shì)，但受精率有所降低，且活產(chǎn)率和臨床妊娠率并未提高。短時(shí)受精短時(shí)受精分兩種：①將COCs從受精液移至新的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；②將COCs移出受精液后對(duì)其進(jìn)行脫顆粒，去除卵丘細(xì)胞及放射冠，使卵母細(xì)胞透明帶完全或大部分暴露，該方法可以同時(shí)觀察第二極體的排出情況，有助于盡早預(yù)測(cè)受精失敗從而避免LFR或TFF的發(fā)生。短時(shí)受精現(xiàn)有研究尚不能證實(shí)短時(shí)受精可顯著改善ART治療結(jié)局。對(duì)于LFR或TFF高風(fēng)險(xiǎn)病例（如精液參數(shù)處于臨界值、不明原因不孕、不孕年限較長、多次人工授精失敗等），可選擇脫顆粒后進(jìn)行早期受精預(yù)判。但需注意的是，受精早期顆粒細(xì)胞較為致密，脫顆粒過程中的機(jī)械應(yīng)力可能對(duì)受精卵產(chǎn)生不利影響；另外，早期脫顆?；蚺c多精受精相關(guān)。對(duì)于繼發(fā)不孕且精液質(zhì)量較好或既往c-IVF受精正常的病例，可采用過夜受精或不進(jìn)行脫顆粒操作的短時(shí)受精。短時(shí)受精推薦意見5：①鑒于尚無更充分的證據(jù)表明過夜受精與短時(shí)受精在活產(chǎn)率方面存在差異，因此兩者均可作為c-IVF的常規(guī)授精方式。②對(duì)于不明原因不孕、多次人工授精（≥3次）失敗、原發(fā)性不孕、繼發(fā)不孕年限≥5年且無其他明顯器質(zhì)性疾?。ㄈ珉p側(cè)輸卵管阻塞、宮腔粘連等）和/或精液質(zhì)量處于臨界值的周期可以采用短時(shí)受精結(jié)合早期脫顆粒方式，通過觀察第二極體排出情況，對(duì)受精情況進(jìn)行早期預(yù)判。③對(duì)于繼發(fā)不孕<5年且精液質(zhì)量較好的周期，若采用短時(shí)受精，也可考慮不進(jìn)行早期卵母細(xì)胞脫顆粒或部分脫顆粒。④對(duì)于獲卵數(shù)≤3枚的周期，為避免誤判可考慮采用過夜受精或短時(shí)受精而不進(jìn)行脫顆粒觀察。如果有條件，也可早期脫顆粒后利用紡錘體觀測(cè)儀輔助判斷受精與否。c-IVF受精失敗的補(bǔ)救ICSI在行c-IVF周期中，當(dāng)?shù)?天（授精后18~24h）發(fā)生TFF時(shí)，可以對(duì)未出現(xiàn)原核的卵母細(xì)胞（僅明確見第一極體）進(jìn)行ICSI，即晚期補(bǔ)救ICSI（laterescueICSI，L-RICSI）。雖然通過L-RICSI可以對(duì)部分病例進(jìn)行挽救，但效果并不理想。2003年早期補(bǔ)救ICSI（earlyrescueICSI，E-RICSI）被首次提出，即通過觀察授精后6h的卵母細(xì)胞是否排出第二極體來判斷受精情況，并對(duì)明確未受精的卵母細(xì)胞（未見第二極體排出）實(shí)施補(bǔ)救ICSI。E-RICSI相較于L-RICSI，可以減少卵子老化對(duì)胚胎發(fā)育的影響，并且胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜生長的同步性也更好。事實(shí)證明，E-RICSI可以獲得比較滿意的治療結(jié)局。目前尚無證據(jù)表明L-RICSI/E-RICSI（相較于c-IVF/ICSI）會(huì)對(duì)子代安全產(chǎn)生負(fù)面影響，但相關(guān)研究有限，亟需更多的長期隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。c-IVF受精失敗的補(bǔ)救ICSI多數(shù)情況下，典型的第二極體較容易判斷，但若極體碎裂或因第二極體排出推遲，則容易造成誤判進(jìn)而出現(xiàn)醫(yī)源性多精受精。尤其部分卵母細(xì)胞受精失敗的周期，行早期補(bǔ)救ICSI會(huì)增加多精受精的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于獲卵數(shù)≤3枚的早期受精觀察，誤判的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增高，同時(shí)也給胚胎實(shí)驗(yàn)室人員帶來壓力。因此早期受精觀察的時(shí)機(jī)和準(zhǔn)確的判斷尤為重要。另外，對(duì)于ACROSIN基因突變導(dǎo)致的c-IVF受精失敗，通過E-RICSI可以實(shí)現(xiàn)正常受精；但對(duì)于PLCζ、ACTL7A、ACTL9、IQCN等基因突變導(dǎo)致的受精失敗則需要利用ICSI結(jié)合人工卵母細(xì)胞激活才可能實(shí)現(xiàn)正常受精。因此，對(duì)于E-RICSI依然受精失敗的患者，條件允許的情況下可以進(jìn)行受精失敗相關(guān)基因的遺傳學(xué)檢查，以明確病因指導(dǎo)后續(xù)ART治療。c-IVF受精失敗的補(bǔ)救ICSI推薦意見6：①E-RICSI的效果明顯優(yōu)于L-RICSI，對(duì)于已實(shí)施L-RICSI的周期，可以考慮將胚胎培養(yǎng)至囊胚階段，再行復(fù)蘇周期移植。②目前仍然以第二極體的排出作為早期受精判斷的依據(jù)，也可結(jié)合紡錘體觀察進(jìn)行輔助判斷。③建議短時(shí)受精時(shí)精卵共孵育4~5h后再行脫顆粒，當(dāng)含有第二極體的卵母細(xì)胞比例<30%~50%時(shí)（分母為成熟卵母細(xì)胞），應(yīng)延遲至授精后6h再行觀察，若含有第二極體的卵母細(xì)胞比例仍<50%，可行補(bǔ)救ICSI；鑒于臨床結(jié)局與補(bǔ)救推遲的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，建議授精后7h之內(nèi)完成補(bǔ)救ICSI。對(duì)于透明帶異常卵母細(xì)胞（如蠟樣透明帶），發(fā)現(xiàn)無第二極體排出時(shí)即直接行補(bǔ)救ICSI操作。受精觀察c-IVF的原核觀察時(shí)間點(diǎn)通常為授精后（17±1）h，即出現(xiàn)2個(gè)原核（twopronuclei，2PN）及2個(gè)極體為正常受精；出現(xiàn)1個(gè)原核（monopronuclear，1PN）或>2個(gè)原核為異常受精；未見原核（nonpronuclear，0PN）多數(shù)情況為未受精，也有少部分是原核出現(xiàn)的時(shí)間不在觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)。因此，結(jié)合相關(guān)的新技術(shù)避免誤判對(duì)于胚胎實(shí)驗(yàn)室正確觀察和處理卵母細(xì)胞非常重要。受精觀察推薦意見7：①不建議將c-IVF的1PN或0PN來源的胚胎直接丟棄，尤其對(duì)于高齡或卵巢儲(chǔ)備低下的患者。由于囊胚培養(yǎng)有利于篩選正常胚胎，故建議對(duì)0PN或1PN來源的卵裂期胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，若形成可利用囊胚，經(jīng)充分知情同意后再行冷凍保存或移植。如果對(duì)這部分胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)篩查，在篩選整倍體胚胎的同時(shí)還需進(jìn)一步排除單親二倍體及多倍體胚胎。由于安全性尚需進(jìn)一步的研究和評(píng)估，故臨床移植0PN或1PN來源的胚胎仍需謹(jǐn)慎。②對(duì)于有條件的中心，也可以考慮將短時(shí)受精并脫顆粒后的卵母細(xì)胞放入時(shí)差成像系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)和觀察，以避免原核早消失造成的誤判。c-IVF在PGT與NICS周期的應(yīng)用2020年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)發(fā)布的PGT指南依然推薦將ICSI作為PGT周期的首選授精方式。選擇ICSI的主要目的是避免精子攜帶的父源性遺傳物質(zhì)的干擾及顆粒細(xì)胞引起的母源性污染。但近幾年的相關(guān)研究顯示，PGT周期中應(yīng)用c-IVF同樣可以獲得與ICSI相似的胚胎發(fā)育結(jié)局和遺傳診斷結(jié)果。因此，對(duì)于非男性因素不育行PGT的病例，ICSI是否仍然作為首選授精方式產(chǎn)生了爭(zhēng)議。2020年美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)和輔助生殖技術(shù)學(xué)會(huì)發(fā)布的非男性因素ICSI適應(yīng)證委員會(huì)意見中指出，在非男性因素行PGT周期的情況下，ICSI僅限在精子DNA可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性造成影響的情況下應(yīng)用。c-IVF在PGT與NICS周期的應(yīng)用這歸因于部分?jǐn)U增技術(shù)（如MALBAC、PicoPLEX）較難擴(kuò)增出精子DNA，父源性污染的發(fā)生率可忽略不計(jì)。但多重置換擴(kuò)增技術(shù)（multipledisplacementamplification，MDA）中使用的堿裂解法對(duì)細(xì)胞裂解效力更強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)精子DNA的擴(kuò)增，因此基于MDA的PGT周期不能選擇c-IVF作為授精方式。2023年國際生殖遺傳學(xué)學(xué)會(huì)發(fā)布的PGT指南認(rèn)為，使用囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢結(jié)合第二代測(cè)序（next-generationsequencing，NGS）技術(shù)的PGT周期，可以采用c-IVF作為授精方式，但應(yīng)盡量避免附著在胚胎上的精子或顆粒細(xì)胞的污染。同樣，也有研究表明在NICS周期中，利用c-IVF與ICSI來源的囊胚培養(yǎng)液進(jìn)行NICS檢測(cè)的結(jié)果相似，并且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢相比無差異。c-IVF在PGT與NICS周期的應(yīng)用推薦意見8：①本共識(shí)建議ICSI作為PGT周期的首選授精方式。對(duì)于胚胎植入前非整倍性檢測(cè)（preimplantationgenetictestingforaneuploidies，PGT-A）周期也可考慮選擇c-IVF作為授精方式，但應(yīng)嚴(yán)格限制使用條件并簽署知情同意書。②基于MDA的PGT周期仍需選擇ICSI授精。③應(yīng)用NICS技術(shù)進(jìn)行胚胎優(yōu)選，可考慮選擇c-IVF授精。c-IVF的質(zhì)量控制及胚胎實(shí)驗(yàn)室新員工培訓(xùn)與考核c-IVF的質(zhì)量控制指標(biāo)及參考標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2017年維也納共識(shí)及《胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵指標(biāo)質(zhì)控專家共識(shí)》中的指導(dǎo)意見，將c-IVF實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控指標(biāo)的計(jì)算方式及參考標(biāo)準(zhǔn)歸納如下，詳見表3。c-IVF的質(zhì)量控制及胚胎實(shí)驗(yàn)室新員工培訓(xùn)與考核2.輔助生殖實(shí)驗(yàn)室新員工培訓(xùn)與考核：c-IVF的技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，應(yīng)從精子動(dòng)靜態(tài)分析、精液的優(yōu)化處理、撿卵、顆粒細(xì)胞去除以及早期受精的判斷（短時(shí)受精）等方面進(jìn)行重點(diǎn)培訓(xùn)。并且培訓(xùn)完成后需通過相應(yīng)的考核方能上崗，當(dāng)考核指標(biāo)和同期同條件下的質(zhì)控指標(biāo)與帶教老師偏差較大時(shí)，應(yīng)積極幫助新員工尋找原因并及時(shí)給予糾正。c-IVF的質(zhì)量控制及胚胎實(shí)驗(yàn)室新員工培訓(xùn)與考核推薦意見9：①輔助生殖實(shí)驗(yàn)室新員工在進(jìn)行崗前培訓(xùn)期間，要求充分掌握《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（第六版）》中ART相關(guān)理論及操作技能，充分了解精子動(dòng)靜態(tài)分析技術(shù)及相關(guān)指標(biāo)臨床意義，并能夠熟練掌握精子濃度、形態(tài)及活動(dòng)率計(jì)數(shù)。②對(duì)不同質(zhì)量精液進(jìn)行優(yōu)化處理時(shí)，當(dāng)處理后TPMC和前向運(yùn)動(dòng)精子百分率與帶教老師差異小于10%后（n=10），方可開始嘗試進(jìn)行臨床操作。c-IVF的質(zhì)量控制及胚胎實(shí)驗(yàn)室新員工培訓(xùn)與考核③新員工須在經(jīng)驗(yàn)豐富的帶教老師指導(dǎo)下完成至少50例撿卵操作并有能力對(duì)COCs進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。④卵母細(xì)胞脫顆粒的前期培訓(xùn)包括巴氏吸管或剝卵針口徑的選擇、剝卵時(shí)吹吸力度、幅度、頻率及體外操作時(shí)間的控制等。操作熟練后，可在帶教老師指導(dǎo)下對(duì)1~2枚卵母細(xì)胞（應(yīng)選擇獲卵數(shù)>15枚的病例）進(jìn)行脫顆粒操作，建議累計(jì)操作至少100枚卵母細(xì)胞，且后續(xù)胚胎發(fā)育指標(biāo)達(dá)到中心同期質(zhì)控要求。⑤當(dāng)對(duì)早期受精進(jìn)行判斷時(shí)，在嚴(yán)格控制體外觀察時(shí)限的情況下判斷結(jié)果與帶教老師差異小于10%后（n=100），方可開始嘗試進(jìn)行臨床操作。相關(guān)操作參考方法1.精液優(yōu)化處理參考方法（1）DGC法：①在15mL離心管中制備非連續(xù)密度梯度離心液，分別取40%~45%上層梯度液和等體積的80%~90%下層梯度液1.0~2.0mL；②將液化后的精液樣本（≤2mL）緩慢沿管壁注入低濃度的梯度離心液上方，（300~500）×g離心15~20min；③棄去上清液或直接吸取精子沉淀，將精子沉淀重懸于1.5~2mL培養(yǎng)液中，（200~300）×g離心5~10min，此步驟可進(jìn)行1~2次。最后棄去上清液，依據(jù)沉淀量將精子重懸于0.5~1.0mL培養(yǎng)基（受精液）中備用，以上方法僅作為參考。相關(guān)操作參考方法（2）SU法：①首先將精液（≤2mL）置于圓底試管中（建議使用容量較大的試管），隨后將1.5~2.0mL培養(yǎng)基輕輕鋪在精液上方，或者將精液（≤2mL）緩慢加入1.5~2.0mL培養(yǎng)基底部。注意保持精液與培養(yǎng)基界面分明。②將試管傾斜45°置于通氣培養(yǎng)箱內(nèi)上游30~60min。③將孵育后的上清液（中上層呈云霧狀液體部分）轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管，（200~300）×g離心5~10min。棄去上清液，將精子沉淀重懸于1.5~2.0mL培養(yǎng)基中，（200~300）×g離心5~10min。最后棄去上清液，依據(jù)沉淀量將精子重懸于0.5~1.0mL培養(yǎng)基（受精液）中備用。相關(guān)操作參考方法（3）DGC聯(lián)合SU法：①首先進(jìn)行DGC法（同上），最終保留0.5~1.0mL的精子沉淀懸液；②將精子懸液移入新的離心管底部，再將1~1.5mL培養(yǎng)基輕輕置于精子沉淀懸液上層，或?qū)⒕映恋響乙狠p輕加入含1~1.5mL新培養(yǎng)基的試管底部；③將試管傾斜45°置于培養(yǎng)箱中上游5~30min，隨后吸取上清液備用。（4）其他新方法：除了上述經(jīng)典方法外，胚胎實(shí)驗(yàn)室宜結(jié)合自身?xiàng)l件與特點(diǎn)進(jìn)行具體方法改良，也可以參照其他相關(guān)新方法進(jìn)行嘗試（如微流控技術(shù)），經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控穩(wěn)定后形成標(biāo)準(zhǔn)操作程序。相關(guān)操作參考方法（5）特殊情況處理：①精液不液化或液化不良的樣本，建議在離心前用巴氏吸管反復(fù)吹打混勻，或加等體積的培養(yǎng)液反復(fù)吹打（盡量避免產(chǎn)生大量氣泡），促其液化后再離心處理；②精液黏稠度較大的樣本，可以添加適當(dāng)培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，再行優(yōu)化處理；③精液里有團(tuán)塊或者膠凍樣物，可將精液轉(zhuǎn)移到15mL尖底離心管內(nèi)，待團(tuán)塊或者膠凍樣物自然沉淀后棄去，再對(duì)樣本進(jìn)行密度梯度離心；④若精液存在絮狀漂浮物，待液化后可采用瞬時(shí)離心方法去除，如將液化后的精液利用Eppendorf的ShortSpin功能瞬時(shí)離心3~5s。相關(guān)操作參考方法2.前向運(yùn)動(dòng)精子濃度的調(diào)節(jié)方法：吸取制備后的精子混懸液10μL，滴入Makler計(jì)數(shù)板，雙人分別計(jì)數(shù)橫豎各10個(gè)小方格后取平均值，計(jì)數(shù)所得前向運(yùn)動(dòng)精子個(gè)數(shù)×106/mL即為前向運(yùn)動(dòng)精子濃度。例如：計(jì)數(shù)