DB22∕T 3353-2022 豬δ冠狀病毒檢測(cè) 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)法

DB22DB22/T3353—2022豬δ冠狀病毒檢測(cè)重組酶聚合酶擴(kuò)增Recombinasepolymeraseamplificationmethodforthedetectionofporcinedeltacoronavirus2022-01-28發(fā)布2022-02-28實(shí)施吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布I1反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增reversetranscription-recombinasepolymerascDNA互補(bǔ)脫氧核糖核酸（ComplementaryPBS磷酸鹽緩沖液（PhosphaRPA開始反應(yīng)后，引物與重組酶組合形成復(fù)合物，在模板中尋找同源雙鏈DNA進(jìn)行定位，完成定位后發(fā)生鏈交換反應(yīng)，形成D-環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使DNA結(jié)合蛋白與單鏈DNA鏈綁定。隨后DNA聚合酶識(shí)別復(fù)2合物中重組酶解離引物后暴露的3′端，進(jìn)行片段擴(kuò)增，形成兩條新的雙鏈DNA，如此循環(huán)，從而完成ATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTAGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGGTCTGG6.1.2磷酸鹽緩沖液（PBS0.01mol/L，pH7.47.2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（4℃,12000r/min）。39.1.1采集腸管組織樣品不少于5g（7.1）。做好9.2.1使用無菌棉簽（6.2.1,7.5采集肛門糞便不少于5g，樣品采集后冷凍或4℃4的擴(kuò)增產(chǎn)物及Marker（6.1.9）分別加入凝膠孔（7.35V/min5Atggctgcaccagtagtccctactactgacgcgtcttggtttcaggtgctcaaagctcaaaataaaaaggctactcatcctcagtttcgtggcaatggaggcttaactccgccatcaaacccgttgaaaaccatggctactggctgcgttacaccagacaaaagccaggtggtactccgattcctccatcctatgccttttattatactggcacaggtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgacaccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacactattaagcctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgaccccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatctgttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgctgcacccgctgcggtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatttctcaggtatttggcaaccggtctcgcactggtgccaatgtcggctctgcagacactgagaagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctctagccagacatgtgcctggtgttcaggagatgcttttcgcccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacctaaaaaggtaactctgccagcagacaaacaggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatcagcagcg將感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α置于冰上，待其融化；在超凈工作臺(tái)中將加入合成質(zhì)粒1μL~3μL加入100μL感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴30min；42℃熱激1min~2min，冰浴1min~2min；加900μL完全吸收后，37℃倒置培養(yǎng)12h~16h。PCR反應(yīng)程序：95℃,5min；95℃,30s；58℃,30s，72℃,1min，72℃,10min，35個(gè)12h~16h。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)含目標(biāo)條帶菌落號(hào)備用。6℃,180rpm,12h~16h；取3mL~5m