第01章 形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)課件

第一章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)生物檢驗(yàn)技術(shù)最主要的是掌握分析方法的一般要求，而在進(jìn)行分析或者檢驗(yàn)之前，一切必須從生物樣品的采集開(kāi)始，還包括樣品的預(yù)處理和制備。隨后的檢驗(yàn)和分析可以千差萬(wàn)別，例如確定病原生物的種類、藥物作用的時(shí)空變化、遺傳基因的改變、食品毒物的含量等，這包括微生物檢驗(yàn)、生物化學(xué)檢驗(yàn)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)。但在這些檢驗(yàn)方法使用之前，必須進(jìn)行一系列的形態(tài)學(xué)檢測(cè)。形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)需要逐步的在不同層次上展開(kāi)進(jìn)行，即感官層次、顯微結(jié)構(gòu)層次和超顯微結(jié)構(gòu)層次。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)生物樣品的采集、預(yù)處理和制備第二節(jié)感官層次的形態(tài)檢驗(yàn)第三節(jié)顯微形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)超顯微形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)生物樣品的采集、預(yù)處理和制備1.1樣品采集的一般要求1.2采樣的最一般方法1.3樣品的制備1.4生物樣品的預(yù)處理第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1.1樣品采集的一般要求采集的生物樣品要具有代表性典型性適時(shí)性第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)代表性指采集的對(duì)象能夠代表一定范圍內(nèi)的整體或者所有的樣品。這就要求對(duì)樣品的分布、類型、特征、地形地貌、環(huán)境、氣候等因素進(jìn)行綜合考慮，選擇合適的地段作為采樣區(qū)，再在采樣區(qū)內(nèi)劃分若干小區(qū)，采用適宜的方法布點(diǎn)，確定有代表性的個(gè)體或樣品。例如在田地里采樣，不要采集田埂、地邊及距田埂地邊2米以內(nèi)的植株。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)典型性指所采集的生物個(gè)體的部位要能充分反映通過(guò)檢驗(yàn)所要了解的情況。根據(jù)要求選取健康的生物個(gè)體，分別采集個(gè)體的不同部位，例如動(dòng)物的血液、尿液、內(nèi)臟、骨髓、腫瘤等，不能將各部位樣品隨意混合。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)適時(shí)性指需要充分注意生物的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段。發(fā)育階段的改變，也影響著樣品的性質(zhì)和生理。有些生物的有效成分在一晝夜間也常有變化，其他如生長(zhǎng)地點(diǎn)、光照、土壤、其他環(huán)境條件等，對(duì)生物樣品的特性均有一定影響。同時(shí)還要注意樣品采取后應(yīng)該及時(shí)處理的時(shí)間。例如生物用藥后的間隔時(shí)間；植物葉類應(yīng)規(guī)定采嫩葉或老葉，采收的時(shí)間及層次，即生長(zhǎng)在植株的不同位置，如上層、中層、下層；花類應(yīng)嚴(yán)格規(guī)定采收時(shí)期及部分，如蕾期、開(kāi)花前期或盛花期，采收全花、花被、柱頭或其他部分等。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)植物標(biāo)本的采集注意事項(xiàng)(1)采集的植物全株樣品最好帶有繁殖器官(花、果或孢子囊、子實(shí)體等)，草本植物特別應(yīng)該注意帶有葉的部分和地下部分，寄生植物應(yīng)帶寄主。(2)如果植物的基部葉與上部葉形狀不同（如菊科、十字花科），葉上的附屬物（毛茸、蠟被等）在新老葉上也有不同，應(yīng)盡量采全。(3)叢生的草本植物，應(yīng)保留其叢生的特征，不要分得太散，失去原來(lái)的習(xí)性(4)雌雄異株的植物（麻黃科、?？频龋?yīng)注意同時(shí)采集雌株和雄株。(5)對(duì)于含水分較多（如景天科、仙人掌科等）或有根狀地下莖植物（如百合科），有時(shí)需切開(kāi)干燥或用開(kāi)水將其燙死。(6)水生藻類植物采的標(biāo)本，到駐地后要重新放在水里，然后用硬臺(tái)紙將其托起，壓成標(biāo)本。(7)木本植物的樹(shù)皮在鑒別上有重要的特征，采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)割取，并與標(biāo)本同存。(8)每種植物至少采集3份以上標(biāo)本，每張標(biāo)本應(yīng)有野外記錄。對(duì)易改變的特征如花的顏色、氣味、毛茸等應(yīng)說(shuō)明。每晚必須及時(shí)整理檢查，補(bǔ)上漏記的項(xiàng)目。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)動(dòng)物樣品的采集動(dòng)物的尿液、血液、糞便、毛發(fā)、指甲、唾液、胃液、乳液、骨骼和組織等均可作為檢驗(yàn)樣品。(1)尿液：絕大部分毒物及其代謝產(chǎn)物主要由腎臟經(jīng)膀胱、尿道隨尿液排出。(2)血液：血液中有害物質(zhì)的濃度可反映近期接觸污染物質(zhì)的水平，并與其吸收量呈正相關(guān)。(3)毛發(fā)和指甲：蓄積在毛發(fā)和指甲中的污染物質(zhì)殘留時(shí)間較長(zhǎng)，即使已脫離接觸污染物或停止攝入污染食物，血液和尿液中污染物含量已下降，而毛發(fā)或指甲中仍容易檢出。頭發(fā)中的汞、砷等含量較高，樣品容易采集和保存，故在醫(yī)學(xué)和環(huán)境分析中應(yīng)用較廣泛。(4)組織和臟器：組織和臟器的部位復(fù)雜，且柔軟、易破裂混合，因此取樣操作要細(xì)心。采集組織和臟器樣品后，應(yīng)放在組織搗碎機(jī)中搗碎、混勻，制成漿狀鮮樣備用。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1.2采樣的最一般方法①采樣前應(yīng)預(yù)先準(zhǔn)備好采樣工具，如刀具、剪刀、保存袋、手套、冰盒、標(biāo)簽、記錄本、采集登記表等；②根據(jù)實(shí)際情況確定樣品采樣量：為了確保有足夠數(shù)量的樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)分析項(xiàng)目的內(nèi)容要求確定樣品的采集量。一般要求樣品經(jīng)制備后，至少有20～50g的干樣品，最好備有1kg的干樣；③整體樣品需要在采樣區(qū)內(nèi)按梅花形五點(diǎn)或交叉間隔的取樣方式采集5-10處的樣品混合組成一個(gè)代表樣品；④生物體上的某一部分作為樣品，如果分布在一個(gè)部位，可以取此部分的全部作為樣品；如果分布在多處，則每處取少量樣品再加以混合。⑤將采好的樣品裝入保存袋中，可能還要放入冰盒中存放，貼好標(biāo)簽，并填寫(xiě)采樣登記表。⑥平均樣的獲得：四分法、切成塊的1/4-1/8混合。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)梅花形五點(diǎn)交叉間隔第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1.3樣品的制備(1)植物鮮樣的制備①洗滌：將樣品用清水、去離子水洗凈，晾干或拭干；②切碎：將晾干的鮮樣切碎、混勻，稱取一定量于電動(dòng)高速組織搗碎機(jī)的搗碎杯中，加適量蒸餾水或去離子水，開(kāi)動(dòng)搗碎機(jī)搗碎1-2min，制成勻漿。對(duì)含水量大的樣品，如熟透的西紅柿等，搗碎時(shí)可以不加水。③研磨：對(duì)于含纖維多或較硬的樣品，如禾木科植物的根、莖桿、葉子等，可用不銹鋼刀或剪刀切（剪）成小片或小塊，混勻后在研缽中加石英砂研磨。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(2)植物干樣的制備①風(fēng)干：將洗凈的植物鮮樣盡快放在干燥通風(fēng)處風(fēng)干（莖桿樣品可以劈開(kāi)）。如果遇到陰雨天或潮濕氣候，可放在40-60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，以免發(fā)霉腐爛，并減少化學(xué)和生物變化。②磨碎：將風(fēng)干或烘干的樣品去除灰塵、雜物，用剪刀剪碎（或先剪碎再烘干），再用磨碎機(jī)磨碎。谷類作物的種子樣品如稻谷等，應(yīng)先脫殼再粉碎。③過(guò)篩：將粉碎好的樣品過(guò)篩。一般要求通過(guò)1mm篩孔即可，有的分析項(xiàng)目要求通過(guò)0.25mm的篩孔。制備好的樣品貯存于磨口玻璃廣口瓶或聚乙烯廣口瓶中備用。④保存：對(duì)于測(cè)定某些金屬含量的樣品，應(yīng)注意避免受金屬器械和篩子等污染。因此，最好用瑪瑙研缽磨碎，尼龍篩過(guò)篩，聚乙烯瓶保存。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1.4生物樣品的預(yù)處理(1)消化分解：使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等消化分解液，初步處理樣品，使大部分蛋白等大分子物質(zhì)在一定程度上降解或去除。(2)提取、分離和濃縮第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)①提取方法：一般將切碎的生物樣品置于容器中，加入適當(dāng)?shù)奶崛∪軇?，振蕩、攪拌或磨碎，浸取一定時(shí)間，濾出溶劑，再用新提取溶劑洗滌樣品濾殘或再浸取一次，合并浸取液，供分析或進(jìn)行分離、富集用。主要有振蕩浸取法、組織搗碎提取法、脂肪提取器提取法、勻漿法等。②分離方法：將目的組分從粗提液中分離出來(lái)有多種方法，主要有萃取法、蒸餾法、層析法、低溫冷凍法等。低溫冷凍法：該方法基于不同物質(zhì)在同一溶劑中的溶解度隨溫度不同而不同的原理進(jìn)行彼此分離的。③濃縮方法：生物樣品的提取液經(jīng)過(guò)分離凈化后，待測(cè)物質(zhì)濃度可能仍達(dá)不到分析方法的要求，這就需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法有：蒸餾或減壓蒸餾法、K-D濃縮器濃縮法、蒸發(fā)法等。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第二節(jié)感官層次的形態(tài)檢驗(yàn)2.1感官法2.2紙片法2.3試管法第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)2.1感官法“看”是感官法最重要的手段?！翱础本褪羌?xì)致的觀察樣品，包括樣品的全貌和樣品各部位的特點(diǎn)，如形狀、顏色、光澤、分泌物、毛、孔、表面和斷面、斑點(diǎn)、刺等。如色黃的植物樣品多含有黃酮類等?！懊本褪怯檬钟|摸、揉捻、撕扯、折切等，感覺(jué)樣品的粗糙程度、堅(jiān)硬程度、斷面特性等。如冬青科和衛(wèi)矛科葉柄拉斷有膠質(zhì)絲。如將果實(shí)和種子放在濾紙上，用力壓碎，稍干后看紙上有無(wú)油跡并估計(jì)含油的多少；檢查鞣質(zhì)類化合物，可用一把無(wú)銹的鐵刀切開(kāi)樣品，如含鞣質(zhì)，小刀及材料斷面很快會(huì)變成蘭黑色?！靶帷本褪怯帽亲勇剺悠窊]發(fā)出的氣味，如把一些樣品揉碎后，嗅其有無(wú)芳香氣味?！皣L”就是用嘴舌來(lái)品嘗，根據(jù)感覺(jué)來(lái)判斷樣品。如植物材料中，味苦的多含生物堿、甙類；味澀的多含鞣質(zhì)，味酸的含有機(jī)酸。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)2.2紙片法取樣品抽提液滴在濾紙上，待展開(kāi)，干后噴灑試液，可以檢查多種成分。①生物堿：噴碘化鉍鉀試液，若斑點(diǎn)顏色顯著加深，為陽(yáng)性反應(yīng)。②酚：醇浸液，噴三氯化鐵試液，若斑點(diǎn)顯蘭綠（黑）色，為陽(yáng)性反應(yīng)。③有機(jī)酸：取水浸液，噴灑溴酚蘭后，背景蘭色，斑點(diǎn)淺黃色，為陽(yáng)性反應(yīng)。④黃酮類：醇浸液，噴三氯化銘醇試液，黃色及熒光均加深，為陽(yáng)性反應(yīng)。⑤蒽醌類：醇浸液，噴氫氧化鉀試液，斑點(diǎn)顯紅色或暗紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。⑥強(qiáng)心甙：醇浸液，加Kedde試液，斑點(diǎn)顯紫色或淺紫色，為陽(yáng)性反應(yīng)。⑦內(nèi)酯及香豆精類：醇浸液，加3％Na2CO3，烤15分鐘，滴加安替匹林及鐵氰化鉀，顯紫紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。檢查山道年（Santonin）可將原料直接加甲醇鈉，顯紫紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。⑧還原物質(zhì)：水及醇浸液，分別噴高錳酸鉀試液，背景紫紅色，斑點(diǎn)色淺或退色，為陽(yáng)性反應(yīng)。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)2.3試管法類似紙片法①皂甙：水浸液置試管中，用力振搖，有持久性泡沫，為陽(yáng)性反應(yīng)。②蛋白質(zhì)：水浸液，加入NaOH、CuSO4，顯淡紫紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。③甙類、糖類：樣品加水用稀酸酸化，煮沸15分鐘過(guò)濾，濾液濃縮后，滴在紙片上，噴鄰苯二甲酸苯胺試液，烘烤，斑點(diǎn)顯棕紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第三節(jié)顯微形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)3.1顯微鏡的基本構(gòu)造 3.2光學(xué)顯微鏡的成像原理3.3顯微鏡的性能3.4顯微鏡的使用操作及注意事項(xiàng)3.5顯微鏡的分類3.5微生物涂片、染色的檢驗(yàn)技術(shù)3.6顯微制片技術(shù)第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.1顯微鏡的構(gòu)造機(jī)械裝置包括：鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推動(dòng)器、粗動(dòng)螺旋、微動(dòng)螺旋等部件。光學(xué)系統(tǒng)包括：反光鏡、聚光器、接物鏡、接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體形成物體放大像。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡常用的目鏡為惠更斯目鏡（Huygenseyepiece），如要進(jìn)行研究用時(shí)，一般選用性能更好的目鏡，如補(bǔ)償目鏡（K）、平場(chǎng)目鏡（P）、廣視場(chǎng)目鏡（WF）。照相時(shí)選用照相目鏡（NFK）。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)物鏡成像的質(zhì)量，對(duì)分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numericalapeature簡(jiǎn)寫(xiě)為NA），每個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。數(shù)值孔徑又叫做鏡口率，它是由物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率n與物鏡孔徑角的一半α的正弦值的乘積，其大小由下式?jīng)Q定：NA=n×sinα第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)NA=n×sinα空氣介質(zhì)油介質(zhì)蓋玻片物鏡第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：A、干燥系物鏡：以空氣為介質(zhì)，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。B、油浸系物鏡：常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×-100×，數(shù)值孔值大于1。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：A、低倍物鏡：1×-6×，NA值0.04-0.15；B、中倍物鏡：6×-25×，NA值0.15-0.40；C、高倍物鏡：25×-63×，NA值0.35-0.95；D、油浸物鏡：90×-100×，NA值1.25-1.40。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)根據(jù)物鏡像差校正的程度來(lái)分類可分為：A、消色差物鏡：是最常用的物鏡，外殼上標(biāo)有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成的色差。鏡檢時(shí)通常與惠更斯目鏡配合使用。B、復(fù)消色差物鏡：物鏡外殼上標(biāo)有“Apo”字樣，除能校正紅、藍(lán)、綠三色光的色差外，還能校正黃色光造成的相差，通常與補(bǔ)償目鏡配合使用。C、特種物鏡：在上述物鏡基礎(chǔ)上，為達(dá)到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如帶校正環(huán)物鏡，帶視場(chǎng)光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無(wú)應(yīng)變物鏡，無(wú)罩物鏡，長(zhǎng)工作距離物鏡等D、目前在研究中常用的物鏡還有：半復(fù)消色差物鏡（FL），平場(chǎng)物鏡(Plan)，平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（PlanApo）,超平場(chǎng)物鏡（Splan，超平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（SplanApo）等。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.2光學(xué)顯微鏡的成像原理第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.3顯微鏡的性能分辨力也叫分辨本領(lǐng)或解像力，光學(xué)顯微鏡分辨力定義為在25cm明視距離處能分辨清楚盡可能靠近的兩點(diǎn)的能力，辨認(rèn)兩點(diǎn)之間的距離愈小，則分辨本領(lǐng)愈高，人眼的分辨力約為100μm

，而顯微鏡的分辨力R以下列公式計(jì)算：

R=0.61λ/NA第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)目前NA最大可以達(dá)到1.4；照明波長(zhǎng)最短為400nm；代入公式可得公式計(jì)算：

R=0.61×0.4/1.4=0.17最大分辨率約0.2微米，約等于可見(jiàn)光最短波長(zhǎng)的一半。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.4顯微鏡的使用操作及注意事項(xiàng)(1)觀察前的準(zhǔn)備(2)低倍鏡觀察(3)高倍鏡觀察(4)油鏡觀察第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.5微生物涂片、染色的檢驗(yàn)技術(shù)細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色。利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)樵谥行?、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡(jiǎn)單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)染色前必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)操作步驟：①涂片→②干燥→③固定→④染色→⑤水洗→⑥干燥→⑦鏡檢第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.6顯微制片技術(shù)一般可分為非切片法與切片法兩大類：非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、整裝片等；切片法又包括石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。應(yīng)用最廣泛的石蠟切片法制作過(guò)程是：取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片→脫蠟→復(fù)水→染色→脫水→透明→封藏。

第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(1)取材和固定固定的目的在于保存組織內(nèi)細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，使其與生活時(shí)相似，因此要求固定的材料越新鮮越好。把動(dòng)物殺死后應(yīng)立即割取組織塊，組織塊的大小以厚度不超過(guò)５mm

為宜，并快速投入固定液中。固定時(shí)間為數(shù)小時(shí)至２４小時(shí)（需視組織塊的大小而定）。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(2)沖洗經(jīng)固定的材料，可根據(jù)不同的固定液，分別用水或酒精沖洗，以洗去固定液，否則固定液留在組織會(huì)有礙染色。一些固定液固定的材料，可直接移入70％酒精中，多換幾次酒精，直至無(wú)黃色時(shí)為止。也可在酒精中加入幾滴氨水或飽和碳酸鋰溶液，以迅速洗去黃色。但留少許黃色也無(wú)妨礙。浸洗后的材料若暫時(shí)不制片，可保存于７０％酒精中。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(3)脫水柔軟并含有多量水分的組織不易切成薄片，故必須增加組織的硬度。石蠟切片法就是使石蠟滲入組織，以達(dá)到支持增硬的作用。但水與石蠟是不相混合的，因此，在浸蠟、包埋前須將組織中的水分完全除去，這一步驟即為脫水。常用的脫水劑是酒精。脫水時(shí)，先從低濃度的酒精開(kāi)始，然后，遞增濃度，直至無(wú)水酒精。具體方法是，將材料經(jīng)70％酒精→80％酒精→95％酒精第一次→95％酒精第二次→無(wú)水酒精第一次→無(wú)水酒精第二次，各級(jí)酒精1-2小時(shí)。脫水應(yīng)徹底，否則材料不能透明，影響石蠟的浸入，致使難以切片。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(4)透明酒精與石蠟不能混和，因此，脫水后的材料在浸蠟前，還必須經(jīng)過(guò)透明。透明劑既可替代組織中的酒精，又能溶解石蠟，以利石蠟的滲入。二甲苯是常用的一種透明劑。將脫水后的材料經(jīng)1：1無(wú)水酒精與二甲苯→二甲苯第一次→二甲苯第二次，各級(jí)時(shí)間為0.5-2小時(shí)，務(wù)使組織達(dá)到透明為止。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(5)浸蠟將已透明的材料移入熔化的石蠟內(nèi)浸漬即為浸蠟。其目的是去除組織中的透明劑，而使石蠟滲入整個(gè)組織，獲得一定的硬度和韌度，以便切成薄的切片。先將裝有56-58℃石蠟的三個(gè)蠟杯放在熔蠟箱內(nèi)熔化，并使熔蠟箱的溫度保持恒定（約58℃），切勿太高或太低。然后將透明了的材料放入蠟杯第一次→蠟杯第二次→蠟杯第三次。浸蠟時(shí)間視材料大小而定，一般總的浸蠟時(shí)間為2-4小時(shí)左右。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(6)包埋將浸蠟后的材料包埋于石蠟中，并使它凝固成蠟塊，這一過(guò)程稱為包埋。包埋前，視組織塊的大小先將繪圖紙折成一紙盒，作為包埋的容器。將紙盒盛滿已熔化的石蠟，隨即將第三杯中已浸蠟的材料放入其中，應(yīng)注意切面朝下，位置放正。然后速將紙盒半浸于冷水中，待石蠟表面凝結(jié)后，將紙盒全部浸入水中冷卻。石蠟全部凝固后，拆去紙盒即成蠟塊。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(7)切片切片前，先將蠟塊用刀片修整成上下兩邊平行的正方形或長(zhǎng)方形，否則切出的蠟帶彎曲不直，或無(wú)法連成帶狀。將修整后的蠟塊粘在小木塊上，小木塊裝在切片機(jī)上，以待切片。在旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上將蠟塊切成4-8μm厚的薄片。薄片最好是連續(xù)的蠟帶。用毛筆輕輕取下蠟帶，放在蠟帶盒內(nèi)備用。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(8)貼片與烤片將蠟片粘貼在載玻片上即為貼片。用小玻棒蘸取一點(diǎn)蛋白甘油滴于一干凈的載玻片上，用手指涂勻，并加幾滴蒸餾水于載玻片上。

將蠟帶按要求切成適當(dāng)長(zhǎng)度的蠟片，然后用小鑷子將蠟片輕放在載玻片的水面上，再把載玻片放在展片臺(tái)上（溫度為45℃左右）。蠟片受熱后即慢慢展平。待完全展平后，用解剖針將切片位置撥正，傾去載玻片上的余水后，將其放在烤片盒中，置于50℃左右恒溫箱內(nèi)烤干。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(9)染色染色劑多為水溶液，故染色前必須先經(jīng)脫蠟、復(fù)水等步驟。以H.E.（蘇木精一伊紅）染色法為例(10)脫水切片依次入95％酒精(Ⅰ)→95％酒精(Ⅱ)→無(wú)水酒精(Ⅰ)→無(wú)水酒精(Ⅱ)，各級(jí)中停留1-5min。(11)透明切片入1：1無(wú)水酒精、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各級(jí)停留1-5min。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)H.E.（蘇木精一伊紅）染色法步驟：A、脫蠟：烤干的切片放入二甲苯→二甲苯中，各為5min，

以溶去切片上的石蠟。B、復(fù)水：是將脫蠟后的切片經(jīng)各級(jí)濃度酒精逐漸下降到水的過(guò)程，即將二甲苯中取出的切片移入無(wú)水酒精→95％酒精→80％酒精→70％酒精→蒸餾水，各級(jí)中停留1-5min。C、染色①將蒸餾水洗滌后的切片移入Harris蘇木精液中5-10min，使細(xì)胞核著色。②用自來(lái)水洗去切片上殘余的染液。③用１％鹽酸酒精分色數(shù)分鐘。分色時(shí)就是褪去細(xì)胞質(zhì)不應(yīng)著色部分的顏色，而使細(xì)胞核著色得清晰適度。分色時(shí)需隨時(shí)用顯微鏡檢查切片，使分色適度。④入１％氨水或自來(lái)水浸洗，使之藍(lán)化。⑤在蒸餾水中浸片刻。⑥切片入70％酒精→80％酒精→90％酒精各1-2min。⑦入0.5％伊紅酒精溶液中染色2-5min，使細(xì)胞質(zhì)著色。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)(12)封藏將切片從二甲苯(Ⅱ)中取出，用紙或布擦去材料周圍的二甲苯。在材料中央滴一小滴樹(shù)膠，然后，用鑷子加蓋蓋玻片。切片封好后，放在切片托盤(pán)上待干燥，即可用于觀察。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈現(xiàn)鮮艷的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)呈粉紅至紅色。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)超顯微形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)透射電子顯微鏡的發(fā)明者E.Ruska（1932）和掃描隧道顯微鏡的發(fā)明者G.Binnig和H.Rohrer（1982）共同獲得1986年度諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。分辨能力從開(kāi)始的幾十納米（nm）提高到0.1~0.2納米，不同功能的電子顯微鏡也逐步出現(xiàn)，應(yīng)用較多的有透射電鏡、掃描電鏡、分析電鏡（具有X射線微區(qū)元素分析功能），具有較大發(fā)展?jié)摿Φ膾呙杷淼里@微鏡等。4.1透射電子顯微鏡4.2掃描電子顯微鏡第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)包括兩大部分：主體部分為照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)和觀察照相室；輔助部分為真空系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)。4.1透射電子顯微鏡

（TransmissionElectronMicroscope，TEM）第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)①照明系統(tǒng)該系統(tǒng)分成兩部分：電子槍和會(huì)聚鏡。電子槍由燈絲(陰極)、柵極和陽(yáng)極組成。加熱燈絲發(fā)射電子束。在陽(yáng)極加電壓，電子加速。陽(yáng)極與陰極間的電位差為總的加速電壓。經(jīng)加速而具有能量的電子從陽(yáng)極板的孔中射出。射出的電子束能量與加速電壓有關(guān)，柵極起控制電子束形狀的作用。電子束有一定的發(fā)散角，經(jīng)會(huì)聚鏡調(diào)節(jié)后，可望得到發(fā)散角，很小甚至為0的平行電子束。電子束的電流密度(束流)可通過(guò)調(diào)節(jié)會(huì)聚鏡的電流來(lái)調(diào)節(jié)。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)②成像系統(tǒng)該系統(tǒng)包括樣品室、物鏡、中間鏡、反差光欄、衍射光欄、投射鏡以及其它電子光學(xué)部件。樣品室有一套機(jī)構(gòu)，保證樣品經(jīng)常更換時(shí)不破壞主體的真空。樣品可在X、Y二方向移動(dòng)，以便找到所要觀察的位置。經(jīng)過(guò)會(huì)聚鏡得到的平行電子束照射到樣品上，穿過(guò)樣品后就帶有反映樣品特征的信息，經(jīng)物鏡和反差光欄作用形成一次電子圖像，再經(jīng)中間鏡和投射鏡放大一次后，在熒光屏上得到最后的電子圖像。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)③觀察照相室電子圖像反映在熒光屏上。熒光發(fā)光和電子束流成正比。把熒光屏換成電子干板，即可照相。干板的感光能力與其波長(zhǎng)有關(guān)。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)④真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)由機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵、離子泵、真空測(cè)量?jī)x表及真空管道組成。它的作用是排除鏡筒內(nèi)氣體，使鏡筒真空度至少要在10-5托以上，目前最好的真空度可以達(dá)到10-9至10-10托。如果真空度低的話，電子與氣體分子之間的碰撞引起散射而影響襯度，還會(huì)使電子?xùn)艠O與陽(yáng)極間高壓電離導(dǎo)致極間放電，殘余的氣體還會(huì)腐蝕燈絲，污染樣品。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)⑤供電控制系統(tǒng)加速電壓和透鏡磁電流不穩(wěn)定將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的色差及降低電鏡的分辨本領(lǐng)，所以加速電壓和透鏡電流的穩(wěn)定度是衡量電鏡性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡的電路主要由以下部分組成，高壓直流電源、透鏡勵(lì)磁電源、偏轉(zhuǎn)器線圈電源、電子槍燈絲加熱電源，以及真空系統(tǒng)控制電路、真空泵電源、照相驅(qū)動(dòng)裝置及自動(dòng)曝光電路等。另外，許多高性能的電鏡上還裝備有掃描附件、能譜議、電子能量損失譜等儀器。第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)投射電鏡制樣技術(shù)第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)掃描電鏡主要用二次電子觀察形貌。在掃描電鏡中，電子槍發(fā)射出來(lái)的電子束，經(jīng)三個(gè)電磁透鏡聚焦后，成直徑為幾個(gè)納米的電子束。末級(jí)透鏡上部的掃描線圈能使電子束在試樣表面上做光柵狀掃描。試樣在電子束作用下，激發(fā)出各種信號(hào)，信號(hào)的強(qiáng)度取決于試樣表面的形貌、受激區(qū)域的成分和晶體取向。4.2掃描電子顯微鏡

（ScanningElectronMicroscope，SEM）第01章形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)掃描電子顯微鏡示意圖設(shè)在試樣附近