第二章細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。光的波長(zhǎng)和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口的張角N.A.=鏡口率（numeric水1細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒4）就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：2.光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。），圖2-6LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管，圖片來自內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量。暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope，圖2-的。利用這種顯微鏡能見到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長(zhǎng)如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：1.環(huán)形光闌（annular?diaphrag成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2.相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位），），物臺(tái)便能檢測(cè)到這種物體。1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基microscope其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡，即DIC棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)Wollaston棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光然存在。最后光束穿過第二個(gè)偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DI影像的反差達(dá)到最佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改變像的亮度。調(diào)節(jié)DIC滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。上（圖2-11用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡?，F(xiàn)在，注重實(shí)用性和多功能方面的改進(jìn)。在裝配設(shè)計(jì)上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska子顯微鏡（transmissione并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電的分辨力可達(dá)0.2nm。左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。電子顯微鏡部分構(gòu)成。X射線波長(zhǎng)（nm）屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)而有電品表面原子凹凸不平，使探針與物質(zhì)表面間的距離不斷發(fā)生改變，從而引起電流不斷發(fā)生改變。而普通電鏡只能觀察制作好的固體標(biāo)本。某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細(xì)胞壁等的原子排列。圖2-20尼康NT-88NE顯微操作/注射儀（圖片來自http://ww顯微操作技術(shù)（micromanipulationtechnique）