酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)教案

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（上）實(shí)驗(yàn)一酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)·底物濃度對(duì)酶活性的影響·pH對(duì)酶活性的影響·溫度對(duì)酶活性的影響華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院20XX級(jí)生物化學(xué)小老師第一組酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)（一）——堿性磷酸酶Km值的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響2.掌握米氏方程、Km值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求Km的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】1.米氏方程：QUOTE(1)式中：v表示酶促反應(yīng)速率，QUOTE表示酶促反應(yīng)最大速率，[S]表示底物濃度，QUOTEKm表示米氏常數(shù)。v=Vmax×[S]/（Km+[S])，這個(gè)方程稱(chēng)為Michaelis-Menten方程，是在假定存在一個(gè)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)條件下推導(dǎo)出來(lái)的，其中Km值稱(chēng)為米氏常數(shù)，Vmax是酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，[S]為底物濃度。由此可見(jiàn)Km值的物理意義為反應(yīng)速度v達(dá)到1/2Vmax時(shí)的底物濃度（即Km=[S]），單位一般為mol/L，只由酶的性質(zhì)決定，而與酶的濃度無(wú)關(guān)?？捎肒m的值鑒別不同的酶。當(dāng)?shù)孜餄舛确浅４髸r(shí)，反應(yīng)速度接近于一個(gè)恒定值。在曲線的這個(gè)區(qū)域，酶幾乎被底物飽和，反應(yīng)相對(duì)于底物S是個(gè)零級(jí)反應(yīng)。就是說(shuō)再增加底物對(duì)反應(yīng)速度沒(méi)有什么影響。反應(yīng)速度逐漸趨近的恒定值稱(chēng)為最大反應(yīng)速度Vmax。米氏常數(shù)Km是酶促反應(yīng)速度v為最大酶促反應(yīng)速度值一半時(shí)的底物濃度。這可通過(guò)用[S]取代米氏方程中的Km證明，通過(guò)計(jì)算可得v=Vmax/2。2.Km值的測(cè)定主要采用圖解法，有四種：①雙曲線作圖法（圖a）根據(jù)公式（1），以v對(duì)[s]作圖，此時(shí)1/2QUOTE時(shí)的底物濃度[s]值即為Km值，以克分子濃度（M）表示。這種方法實(shí)際上很少采用，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)條件下的底物濃度很難使酶達(dá)到飽和。實(shí)測(cè)QUOTE一個(gè)近似值，因而1/2QUOTE不精確。此外由于v對(duì)[S]的關(guān)系呈雙曲線，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)要求較多，且不易繪制。②Lineweaver-Burk作圖法—雙倒數(shù)作圖法（圖b）實(shí)際工作中，常將米氏方程（式（1））作數(shù)學(xué)變換，使之成為直線形式，測(cè)定要方便、精確得多。其中之一即?。?）式的倒數(shù)，變換為L(zhǎng)ineweaver-Burk方程式：QUOTE(2)以1vQUOTE對(duì)1[S]作圖，即為y=ax+b形式。此時(shí)斜率為QUOTE，縱截距為QUOTE。把直線外推與橫軸相交，其截距即為—QUOTE。③Hofstee作圖法（圖略,不要求）把（2）式等號(hào)兩邊乘以Vmax，得：QUOTE(3)以v對(duì)QUOTE作圖，這時(shí)斜率為QUOTE，縱截距為QUOTE，橫截距為QUOTE。④Hanas作圖法（圖略，不要求）把（2）式等號(hào)兩邊乘以[S],得：QUOTE(4)以v對(duì)QUOTE作圖，這時(shí)斜率為QUOTE，縱截距為QUOTE。（a）(b)本實(shí)驗(yàn)主要以雙倒數(shù)法，即Lineweaver-Burk作圖法來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶Km值。具體原理如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物，堿性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，在適宜條件下，準(zhǔn)確反應(yīng)15分鐘。在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍(lán)色化合物，以波長(zhǎng)660nm比色。在一定條件下色澤深淺與光密度成正比。反應(yīng)式如下：然后以光密度直接表示不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速度（思考分析這樣處理的原理及合理性），即以光密度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖法來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶Km值?！緝x器與試劑】?jī)x器：恒溫水浴鍋；721型分光光度計(jì)；試管；吸量管；移液槍?zhuān)粺Ｔ噭悍釉噭?.5mM磷酸苯二鈉基質(zhì)液堿性緩沖液（pH10.0）堿性磷酸酶【注意事項(xiàng)】1.加入堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確，并且提前進(jìn)行預(yù)熱。2.保溫時(shí)間要準(zhǔn)確，不同試管加熱時(shí)間須保持一致，注意計(jì)時(shí)方法。3、磷酸苯二鈉為2.5mmol/L，注意與后兩個(gè)試驗(yàn)區(qū)分。4、使用分光光度計(jì)和移液槍時(shí)注意操作步驟?！緦?shí)驗(yàn)步驟】取6支試管按下表加入試劑：0號(hào)管切勿加酶！0123452.5mM磷酸苯二鈉（mL）1.00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）0.20.80.60.40.2------堿性緩沖液（pH10.0）（mL）1.01.01.01.01.01.0混勻后，37℃預(yù)溫5分鐘。注意：堿性磷酸酶溶液應(yīng)先放于水浴鍋中預(yù)熱達(dá)到37℃，再滴加到試管中參與反應(yīng)堿性磷酸酶液（mL）------0.20.20.20.20.2混勻后，37℃水浴15分鐘（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）。注意：1）加入堿性磷酸酶液要快速、準(zhǔn)確。（用移液槍加）2）酶促反應(yīng)溶液總體積2.2mL。3）第0管不加酶，基本無(wú)反應(yīng)。酚試劑（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(mL)2.02.02.02.02.02.0混勻后，37℃水浴15分鐘（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）。注意：1）酚試劑為顯色劑，同時(shí)為酶的變性劑，故加入酚試劑后酶促反應(yīng)停止。2）Na2CO3提供堿性環(huán)境，加入Na2CO3后試劑才顯色，37℃水浴使顯色充分。以0號(hào)管調(diào)零，在660nm波長(zhǎng)處比色?！窘Y(jié)果處理】1．將各管光密度和底物濃度記入下表:管號(hào)12345O.D1O.D2O.D3O.D（均值）1/O.D[S]請(qǐng)自行計(jì)算1/[S]2．以1/O.D為縱坐標(biāo)，1/[s]為橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖，求出堿性磷酸酶的Km值,并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)（二）——PH對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私釶H對(duì)酶活性及酶促反應(yīng)速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。【實(shí)驗(yàn)原理】大部分酶活力受其環(huán)境pH的影響。在一定的pH下，酶反應(yīng)具有最大速度，高于或低于此值，反應(yīng)速度下降，通常稱(chēng)此pH值為酶反應(yīng)的最適pH。不同的酶具有不同的最適pH?！緝x器與試劑】?jī)x器：1.恒溫水浴鍋；2.試管和試管架；3.移液槍及槍頭；4.721型分光光度計(jì)；5.移液管。試劑：1、0.01M磷酸苯二鈉。2、堿性磷酸酶液（pH=10）。3、不同pH緩沖液。4、酚試劑和10%Na2CO3溶液?！咀⒁馐马?xiàng)】1、堿性磷酸酶溶液應(yīng)先放于水浴鍋中預(yù)熱達(dá)到37℃，再滴加到試管中參與反應(yīng)2、注意磷酸苯二鈉為0.01mmol/L，與實(shí)驗(yàn)一不同【實(shí)驗(yàn)步驟】取六支潔凈試管，編號(hào)后按表操作：管號(hào)0123450.01M磷酸苯二鈉（mL）0.30.30.30.30.30.3緩沖溶液蒸餾水1.2mLpH91.0mLpH101.0mLpH111.0mLpH121.0mLpH>121.0mL混勻，置于37℃水浴5min。注意：堿性磷酸酶溶液應(yīng)先置于水浴鍋中預(yù)熱到37℃，再滴加到試管中參與反應(yīng)堿性磷酸酶液（mL）-----0.20.20.20.20.2混勻，再置于37℃水浴15min。酚試劑（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(mL)2.02.02.02.02.02.0混勻后，置于37℃水浴中再次保溫15min，然后以第0管調(diào)零點(diǎn)，用660nm波長(zhǎng)比色。以各管pH為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪制曲線，從曲線上可大致得出堿性磷酸酶的最適pH。【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值），以pH為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制圖，根據(jù)圖象做出合理分析。實(shí)驗(yàn)（三）——溫度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私鉁囟葘?duì)酶活性及酶促反應(yīng)速率的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。一般而言，若酶處于過(guò)高的溫度環(huán)境中，會(huì)使酶活性永久喪失；而若處于極低溫度的環(huán)境中只會(huì)使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會(huì)全部或部分的恢復(fù)其活性?！緝x器與試劑】?jī)x器：1.恒溫水浴鍋；2.試管和試管架；3.移液槍及槍頭；4.721型分光光度計(jì)；5.移液管。試劑：堿性緩沖液：同實(shí)驗(yàn)一中堿性緩沖液配制（pH=10）；0.01M磷酸苯二鈉；酚試劑；堿性磷酸酶液；10%Na2CO3溶液；【注意事項(xiàng)】1.加入堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確。2.保溫時(shí)間要準(zhǔn)確，注意計(jì)時(shí)方法。3.將試管從水浴鍋中拿出后再加入酚試劑和碳酸鈉溶液，立即搖勻之后在室溫下放置15min?！咀⒁馐马?xiàng)】1.加入堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確，并且提前放入不同溫度水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱。2.對(duì)反應(yīng)溫度的控制要嚴(yán)格，不同溫度下反應(yīng)的時(shí)間必須保證一樣，建議每隔一分鐘向裝有底物的試管中加入酶液，便于用秒表計(jì)時(shí)。3.將試管從水浴鍋中拿出后再加入酚試劑和碳酸鈉溶液，立即搖勻之后在室溫下放置15min。4、注意磷酸苯二鈉為0.01mmol/L，與實(shí)驗(yàn)一不同【實(shí)驗(yàn)步驟】取6支潔凈試管，參照下表加入試劑：0123450.01M磷酸苯二鈉（mL）0.30.30.30.30.30.3堿性緩沖液（mL）1.21.01.01.01.01.0混勻后，將0~5管分別置于室溫、37℃、50℃、60℃、70℃和80℃中水浴5min；注意：堿性磷酸酶溶液應(yīng)先放于不同水浴鍋中預(yù)熱，再滴加到試管中參與反應(yīng)堿性磷酸酶液（mL）------0.20.20.20.20.2混勻后，繼續(xù)原溫度水浴加熱15min（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）。酚試劑（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(mL)2.02.02.02.02.02.0混勻后，室溫放置15min后，以第0管調(diào)零，用660nm波長(zhǎng)比色。再以溫度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制曲線。從曲線上可得出此實(shí)驗(yàn)條件下堿性磷酸酶的最適溫度?！窘Y(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值），以溫度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制圖，根據(jù)圖象做出合理分析【思考題】1.反應(yīng)時(shí)間15min是經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出的較好結(jié)果，試分析時(shí)間長(zhǎng)了或短了會(huì)有何影響?2.回答實(shí)驗(yàn)原理中括號(hào)中的思考題3.第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中兩次水浴的目的分別是什么，去掉其中一個(gè)行不行，為何？附錄儀器操作規(guī)范與注意事項(xiàng)移液槍使用注意事項(xiàng)：不使用時(shí)，請(qǐng)豎直放置；槍頭為一次性，可多次吸取同一種液體，不可吸取不同液體；吸液時(shí)，拇指向下壓到有阻力，然后輕輕釋放（一定不能松開(kāi)拇指），防止液體因慣性沖入移液管；吸液時(shí)，槍頭內(nèi)不能有氣泡。規(guī)范操作：取移液槍調(diào)至所需加液用量，套上槍頭，大拇指摁下按鈕到剛有阻力時(shí)將槍頭伸入液體中，輕輕吸上液體，放出液體時(shí)按鈕按到底即可。移液管使用注意事項(xiàng)：使用前必須清洗干凈，用吸水紙將尖端內(nèi)外的水除去，然后用待吸溶液洗三次，洗的時(shí)候，吸取液體約占管身的三分之一，將移液管潤(rùn)洗即可。洗過(guò)的溶液應(yīng)從流液口放出棄之。吸收溶液時(shí)，管尖應(yīng)深入液面10-20mm,并隨液面下降而下降，用洗耳球在移液管另一側(cè)將液體吸入管中，（切忌用嘴吸）吸液時(shí)，手應(yīng)慢慢放松洗耳球，避免讓移液管內(nèi)液體上升太快導(dǎo)致液體沖入洗耳球中；另外不要讓液面升得太高，使管壁沾附過(guò)多的液體，以免在調(diào)定液面和排液時(shí)流下來(lái)，影響容量的準(zhǔn)確度。調(diào)定液面或放液時(shí)吸管均應(yīng)垂直放置，其流液口與容器內(nèi)壁相接觸，接受容器須傾斜30°，移液管者始終保持垂直。為保證液體完全流出，要等待約3秒鐘，方可拿開(kāi)。4.吸管內(nèi)的溶液按規(guī)定方法排出后，移液管尖嘴的殘留液，如果移液管上沒(méi)有標(biāo)明“吹”的字樣，不能排到接受容器中，若有，則用洗耳球?qū)⑹Ｓ嘁后w吹入。注：當(dāng)吸取有毒或腐蝕性液體，可選用有安全泡的吸管，并使用吸具（如洗耳球等）操作移液管規(guī)范操作：使用移液管前，先看移液管上的標(biāo)記，刻度線位置，檢查管頭是否損壞。潤(rùn)洗時(shí)，先慢慢吸入移液管長(zhǎng)度的1/3左右，將移液管橫置，并轉(zhuǎn)動(dòng)移液管使溶液接觸到刻度線以上的部分，進(jìn)行潤(rùn)洗。隨后將溶液由管下口棄去，并用洗耳球吹去殘余液體。反復(fù)潤(rùn)洗三次。分光光度計(jì)使用步驟預(yù)熱使用前插上插頭。打開(kāi)開(kāi)關(guān)，預(yù)熱20min。二.選定波長(zhǎng)三．調(diào)零：1.將黑色比色皿和參比液放入培養(yǎng)皿內(nèi)，并將黑色培養(yǎng)皿拉入光路，按模式鍵調(diào)至T，按0%鍵將透光率調(diào)為0。2.拉動(dòng)伸縮桿，將參比液拉入光路，按100%鍵，將透光率調(diào)為100。3.再按模式鍵調(diào)至A模式，顯示屏顯示0.00即可。四．樣品測(cè)定將待測(cè)樣品拉入光路，顯示屏上的示數(shù)即為光密度值。保持光路中的樣品不變，打開(kāi)蓋子，再將蓋子蓋上，則再次讀出光密度值，重復(fù)測(cè)量三次，取其平均值，即為該樣品的光密度值。五．實(shí)驗(yàn)完畢清理儀器，將比色皿洗干凈，用濾紙吸干，再用擦鏡紙順一個(gè)方向擦干，放入盒子內(nèi)。最后關(guān)閉電源，拔掉插頭。注意事項(xiàng)：預(yù)熱和不測(cè)定時(shí)應(yīng)將暗箱蓋打開(kāi)，以延長(zhǎng)光電管壽命測(cè)定系列溶液時(shí)，應(yīng)從稀到濃的順序讀數(shù)應(yīng)在0.1-1.0間.注意調(diào)零校準(zhǔn)。注意若分光計(jì)示數(shù)不穩(wěn)定，立即檢查比色皿是否干凈，波長(zhǎng)是否為660nm。

使用比色皿注意事項(xiàng)：1.比色