DB21T 2734.1-2017 病菌PCR 分型診斷方法 第1部分：大腸桿菌PCR 檢測方法　　

DB21DB21/T2734.1—2017病菌PCR分型診斷方法MethodofPCRtypingdiagnosisforbacterialPart1：MethodofPCRdetectionforEscherichiacoli2017-02-23發(fā)布2017-03-23實(shí)施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2734.1—2017 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 5 5A.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶 5A.1.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸) 5 5DB21/T2734.1—2017本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙鳳菊、趙曉彤、關(guān)淼、關(guān)乃鵬、李蓉、陳瑤、張雅為、魏澍、李冰、高慎1DB21/T2734.1—2017本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用GB16548-2006病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安SN/T2025-2007動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室生物安GB/T555-2002動(dòng)物產(chǎn)品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測E.coli：大腸桿菌（Escherichiacoli）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreactidNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-riTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerasTAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuf點(diǎn)，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈5儀器和器材2DB21/T2734.1—2017微量移液器和吸頭等。6.2無水乙醇：-20℃預(yù)冷。6.375%乙醇：用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-上游引物序列為5’-GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’下游引物序列為5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’6.8陽性對(duì)照：E.coliATCC26.10TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳7.1樣品的采集、前處理、存放與運(yùn)輸采樣及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣采取病死或剖殺動(dòng)物主要臟器（肝臟、脾臟、肺臟）裝入滅菌15mL離心管中，編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)稱取1g病料進(jìn)行研磨，然后加入1mL無菌生理鹽水，混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。7.1.4內(nèi)容物的采集與前處理采取病死或剖殺動(dòng)物的小腸內(nèi)容物，裝入15mL滅菌離心管中，按1﹕5倍體積加入無菌生理鹽水，混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。3DB21/T2734.1—20177.1.5糞便的采集與前處理用藥匙無菌采取發(fā)病動(dòng)物新鮮糞便，裝入15mL滅菌離心管中，按1﹕5倍體積加入無菌生理鹽水，混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。7.1.6血液無菌采集心血，按1﹕1倍體積加入無菌生理鹽水，混勻，轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中編號(hào)備7.1.7大腸桿菌純培養(yǎng)物挑取37℃18～24h培養(yǎng)的典型菌落，用1mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。然后轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中編號(hào)備用，待檢。采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過3次)。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6~8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。7.2PCR檢測7.2.1.1取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對(duì)照7.2.1.3取與7.2.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，吸取900μL上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管7.2.1.44℃12000g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL75%乙7.2.1.54℃12000g離心5min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。如此洗2次。7.2.1.64000g離心10s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min。7.2.1.7加入20μL經(jīng)高壓處理的水，輕柔混勻，溶解管壁上的DNA，冰上保存?zhèn)溆?；若需長期保存應(yīng)放置-70℃冰箱。建立25μL反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專用離心管中：滅菌蒸餾水10×PCRBuffer2.5mmol/LdNTPExTaqDNA聚合酶上游特異性PCR引物下游特異性PCR引物4DB21/T2734.1—201794℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）板點(diǎn)樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DL2000DNAMarker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物），緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。8試驗(yàn)成立的條件當(dāng)陽性對(duì)照出現(xiàn)272bp擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶時(shí)，試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)無效。9結(jié)果判定紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，試驗(yàn)條件成立時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為判定依據(jù)。如被檢樣品出現(xiàn)272bp擴(kuò)增條帶，則可初步判斷為E.coli核酸陽性，初步判斷為陽性結(jié)果的樣品可結(jié)合流行病學(xué)特征、臨床癥狀、剖檢變化、生化特性或核酸序列測定進(jìn)行確認(rèn)。如被檢樣品未出現(xiàn)272bp擴(kuò)增條帶的樣品判為E.coli核酸陰性。5DB21/T2734.1—2017 A.1.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.A.1.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸)電泳緩沖液(5調(diào)pH至8.0