DB21T 2427-2015 海洋褐潮監(jiān)測技術(shù)規(guī)程　

ICS13.020.01DB21DB21/T2427—2015海洋褐潮監(jiān)測技術(shù)規(guī)程Technicalspecificationforbrowntideminitoring遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2427—2015本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋與漁業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院（遼寧省海洋環(huán)境監(jiān)測總站）。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋倫、王年斌、劉衛(wèi)東、宋廣軍、吳金浩、宋永剛、李楠、吳景、鮑相勃。1DB21/T2427—2015本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海洋褐潮監(jiān)測術(shù)語和定義、監(jiān)測的內(nèi)容、技術(shù)要求和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于遼寧省管轄海域所進行的褐潮監(jiān)測工作。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3097海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB17378.2海洋監(jiān)測規(guī)范第2部分：數(shù)據(jù)處理與分析質(zhì)量控制GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運輸GB17378.4海洋監(jiān)測規(guī)范第4部分：海水分析GB17378.7海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測GB/T12763.2海洋調(diào)查規(guī)范第2部分：海洋水文觀測GB/T12763.3海洋調(diào)查規(guī)范第3部分：海洋氣象觀測GB/T12763.4海洋調(diào)查規(guī)范第4部分：海水化學(xué)要素觀測GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查GB/T12763.9海洋調(diào)查規(guī)范第9部分：海洋生態(tài)調(diào)查指南HY/T069海洋赤潮監(jiān)測技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語適用于本規(guī)程。3.1微微型浮游植物picophytoplankton微微型浮游植物是指細(xì)胞直徑在0.2-3μm之間的浮游植物，包括聚球藻、原綠球藻和真核微微型藻類。3.2褐潮browntide即“微微型浮游植物赤潮”，是由海洋中的一些微微型藻類在一定環(huán)境條件下暴發(fā)性增殖或聚集達到某一水平，引起水體變色或?qū)Ｑ笾衅渌锂a(chǎn)生危害的一種生態(tài)異常現(xiàn)象。3.3褐潮生物brown-tideorganisms2DB21/T2427—2015能夠大量繁殖并引發(fā)褐潮的微微型浮游植物。3.4褐潮生物量brown-tidebiomass指調(diào)查海域的微微型浮游生物群落組成中，褐潮生物種類在單位水體中的個體數(shù)。3.5分子鑒定moleculebiologyidentification通過真核浮游生物18SrDNA序列比對，鑒定不同微微型藻類種屬的方法。3.6常規(guī)監(jiān)測routingmonitoring通過對褐潮可能發(fā)生水域進行化學(xué)、生物要素的取樣、分析和水文、氣象要素觀測，監(jiān)測褐潮生物數(shù)量的時空分布，監(jiān)視褐潮的發(fā)生及發(fā)展動向。跟蹤監(jiān)測trackingmonitoring指對已形成的褐潮全過程的跟蹤、取樣、分析工作，監(jiān)測褐潮生物的發(fā)生、發(fā)展和漂移情況。4褐潮監(jiān)測4.1站位布設(shè)4.1.1布設(shè)原則——站位應(yīng)布設(shè)在預(yù)期的褐潮多發(fā)海域；——盡可能與海洋環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測站位位置相一致；——應(yīng)考慮監(jiān)測海域的水動力狀況和功能，選擇上升流區(qū)、漁場和增養(yǎng)殖區(qū)布設(shè)站位；——站位的布設(shè)應(yīng)覆蓋或代表監(jiān)測海域。4.1.2布站方法4.1.2.1常規(guī)監(jiān)測根據(jù)實際情況，采用T型（河口近岸海域）、井字型、梅花型、網(wǎng)格型，布設(shè)控制斷面和監(jiān)測站位。4.1.2.2跟蹤監(jiān)測根據(jù)褐潮發(fā)生的范圍和漂移狀態(tài)，分別在褐潮發(fā)生區(qū)的內(nèi)、外水域分別設(shè)立褐潮區(qū)站位和對照站位，站位數(shù)量應(yīng)隨褐潮發(fā)生區(qū)范圍的擴展而增加。4.2監(jiān)測時段、頻率、范圍4.2.1監(jiān)測時段、頻率常規(guī)監(jiān)測：5月和8月為每月1次至2次；6-7月為每周1次；發(fā)現(xiàn)褐潮征兆起每3天監(jiān)測1次。跟蹤監(jiān)測：從褐潮發(fā)生起至褐潮消失止，每天1次或酌情增加次數(shù)。4.2.2監(jiān)測范圍3DB21/T2427—2015監(jiān)測微微型藻類密度達到107個/L以上或海水顏色異常最外圍邊緣包含的水域范圍。采用衛(wèi)星遙感、航空遙感或船舶GPS定位方法界定海水異常范圍及坐標(biāo)，記錄褐潮發(fā)生面積、位置及時間要素。4.3監(jiān)測項目褐潮監(jiān)測項目見表1。表1褐潮監(jiān)測項目及分析方法一覽表指標(biāo)監(jiān)測項目分析方法采用標(biāo)準(zhǔn)觀測項目褐潮范圍船舶、航空GPS定位，衛(wèi)星定位褐潮圖象錄像、攝像色、味、嗅、漂浮物目視及感官GB17378.7水文氣象要素海表水溫表層水溫表法GB17378.4水色比色法GB17378.4透明度透明圓盤法GB17378.4生物學(xué)要素微微型真核生物種類18SrDNA高變區(qū)序列比對法附錄A小型浮游植物種類及數(shù)量沉降、直接、濃縮計數(shù)法（水樣）GB17378.7葉綠素-a熒光分光光度法GB17378.7化學(xué)要素pH現(xiàn)場快速測定儀法或pH計法GB17378.4溶解氧現(xiàn)場快速測定儀法或碘量法GB17378.4氨次溴酸鹽氧化法GB17378.4亞硝酸鹽萘乙二胺分光光度法GB17378.4硝酸鹽鎘柱還原法GB17378.4無機磷磷鉬藍分光光度法GB17378.44.4監(jiān)測備航褐潮監(jiān)測備航應(yīng)準(zhǔn)備-20℃冰柜或液氮罐、采水器、抽濾裝置、500ml廣口瓶、5000ml采樣桶、微孔濾膜（孔徑為0.22μm）以及固定劑，固定劑配制和使用按GB/T12763.6執(zhí)行。4.5現(xiàn)場觀測、調(diào)查現(xiàn)場觀測海區(qū)水色、味、嗅、漂浮物，向漁民調(diào)查監(jiān)測海區(qū)是否有水體變色、異味、異常飄浮物或海產(chǎn)品死亡以及貝類滯長等異常現(xiàn)象。5褐潮判別與分析指標(biāo)5.1感官指標(biāo)海水的顏色、嗅味和透明度等是初步判定水域是否發(fā)生褐潮的直觀指標(biāo)。顏色變化，海水透明度低，產(chǎn)生惡臭，發(fā)粘等是發(fā)生褐潮的指標(biāo)性特征。5.2生物量指標(biāo)4DB21/T2427—2015參照《海洋赤潮監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》（HY/T069-2005）中赤潮判別與生物量分級標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)微微型生物密度>107個/升警戒值時即判為褐潮。小于該警戒密度值而恢復(fù)到海域原有的生物量，可視為正?；蚝殖毕顟B(tài)。6海洋褐潮監(jiān)測數(shù)據(jù)報表海洋褐潮監(jiān)測數(shù)據(jù)報表應(yīng)滿足附錄B的要求。__________________________________5DB21/T2427—2015（規(guī)范性附錄）微微型真核生物監(jiān)測方法A.1樣品采集與預(yù)處理采集2-5L表層海水，首先經(jīng)200目的篩絹過濾，然后用0.22μm孔徑的硝酸纖維素膜收集微微型、微型及小型浮游生物，將濾膜轉(zhuǎn)移至10mL無菌離心管中，置于-20℃或-80℃冷凍，用于微微型真核生物的分析。A.2DNA的提取A.2.1裂解藻細(xì)胞上述過濾濾膜移入1.5mL滅菌離心管中，用滅菌剪刀將其剪碎，加入500μLCTAB緩沖液、1μL巰基乙醇、5μL蛋白酶K混和均勻，放入55℃空氣浴中1~2h，直到藻液呈透明狀；A.2.2抽提加入300μL飽和酚，300μLCI(氯仿:異戊醇=24：1)輕柔顛倒5min，使之呈乳濁液；14000×g4℃離心10min，小心用微量吸頭取出上清液(約500μL)至無菌離心管中，加入500μLCI混勻，14000×g4℃離心10min。A.2.3沉淀小心用微量吸頭取出上清液(約400μL)至無菌離心管中，加二倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的NaAc，充分混勻，放入-20℃冰箱30min；14000×g4℃離心10min，小心棄上清；A.2.4洗滌DNA沉淀用預(yù)冷的70％酒精洗兩次，每次洗滌后都需離心，小心棄上清；A.2.5溶解將沉淀真空干燥或自然晾干，溶于20-40μLTE緩沖液中，置于-20℃待用；A.3PCR及純化、克隆A.3.1PCR引物、反應(yīng)體系18SF:5′-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3′18SR:5′-CCTTGTTAACGACTTCACCTTCCTCT-3′PCR反應(yīng)體系包括：模板DNA（稀釋10倍）2.5μLdNTPMixture（各2.5mM）8μL10μM引物各2μL6DB21/T2427—2015LaTaq（5U/μL）0.5μL10×LAPCRBufferⅡ(Mg2+plus)5μLA.3.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33個循環(huán)；72℃延伸10min；A.3.3擴增產(chǎn)物檢測1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；A.3.4純化采用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒，嚴(yán)格按照步驟操作；A.3.5質(zhì)粒的連接DNA的克隆采用克隆試劑盒，嚴(yán)格按照步驟操作；A.3.6轉(zhuǎn)化取200μL搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液，加入上述連接質(zhì)粒4μL，用槍輕輕吹打均勻，冰浴30min。42℃,保溫90s后，迅速放入冰中，冰浴5min。加入37℃預(yù)熱的1mL的LB液體培養(yǎng)基，混勻。37℃培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)。3000rpm離心10min。棄去1mL上清，余下的200μL用槍輕輕吹打均勻，使細(xì)菌充分懸浮后均勻涂布于篩選平板上（20mg/mL的X-Gal、4mL200mg/mL的IPTG、50mg/mLAmp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基）。37℃正面向上放置0.5h后，倒置培養(yǎng)8-12h。制備好加抗生素的液體體培養(yǎng)基，每個1.5mL離心管中加入1000μL培養(yǎng)基，挑選白色菌落，放入上述分裝好的培養(yǎng)基中，37℃200轉(zhuǎn)搖菌6h左右。以上述菌液為模板，按照A.3.1至的A.3.3的方法進行PCR擴增和檢測，PCR產(chǎn)物片段長度與18s擴增PCR產(chǎn)物相同者可送交測序。A.4克隆子測序?qū)⑸鲜鰴z測合格的菌液送交生物測序公司進行DNA片段測序。其中褐潮前期測序的克隆數(shù)量為100個，褐潮暴發(fā)期選擇測序的克隆數(shù)量為50個。A.5比對分析將得到的DNA片段序列輸入GenBank進行比對，一致性達到95%以上者可認(rèn)為是一致的物種，查找對應(yīng)種類拉丁文及中文名，進而分析所采集的海水中微微型真核生物的種類、數(shù)量等信息。A.6數(shù)量統(tǒng)計鏡檢同期水樣中小型浮游植物種類和數(shù)量，根據(jù)微微型和小型浮游植物測序基因克隆比例，分別計算微微型真核生物數(shù)量。7DB21/T2427—2015（規(guī)范性附錄）表B.1小型浮游植物細(xì)胞數(shù)量計數(shù)記錄表標(biāo)本編號站號水深（m）采水量（mL）濃縮體積（mL）記數(shù)體積（mL）調(diào)查時間記數(shù)時間序號種名數(shù)量小計統(tǒng)計（個/L）備注123456789202122232425硅藻種數(shù)（種）數(shù)量（個）甲藻種數(shù)（種）數(shù)量（個）其它（種）數(shù)量（個）總量（個）分析者校對者審核者8DB21/T2427—2015表B.2微微型真核生物數(shù)量統(tǒng)計表標(biāo)本編號站號采水量