實驗三酶聯(lián)免疫吸附試驗

BioengineeringCollegeDalianUniversity定義：

利用抗體分子能與抗原分子特異性結合的特點，將游離的雜蛋白和結合于固相載體的目的蛋白分離，并利用特殊的標記物對其定性或定量分析的一種檢測方法。BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）基本原理BioengineeringCollegeDalianUniversity基本原理

三個基本原理抗原或抗體能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗體能與酶通過共價鍵形成酶結合物，同時保持各自的免疫活性和酶活性；酶結合物與相應的抗原或抗體結合后，能通過加入底物的顏色反應來確定免疫反應的發(fā)生，顏色反應的深淺與標本中相應抗原或抗體的量成正比。BioengineeringCollegeDalianUniversity

是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結合形成酶標抗原-抗體復合物，加入酶反應底物，測定產(chǎn)物的吸光值。直接法：ELISA方法的分類BioengineeringCollegeDalianUniversity

是當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結合形成復合后，再以酶標二抗和復合物結合，加入酶反應底物，測定產(chǎn)物的吸光值。間接法：BioengineeringCollegeDalianUniversity

是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與抗原反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物

。夾心法：BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity96孔酶標板

包被抗原（牛血清白蛋白，BSA）；封閉液（3%脫脂奶粉）

兔抗BSA抗體

酶標記羊抗兔IgG抗體（酶標記物）；

底物

（OPD）；抗體稀釋液（PBS）；

洗滌液（PBS-0.05%Tween20）；

反應終止液

（2N硫酸）。試劑BioengineeringCollegeDalianUniversity實驗步驟1.抗原的處理：2.包被抗原：取酶標板，加入50μL/孔的抗原稀釋液（5ug/孔）37℃，放置1.5h抗原50ug/ul利用PBS稀釋抗原500倍1234AB56789101112123456789101112BioengineeringCollegeDalianUniversity包被：將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。BioengineeringCollegeDalianUniversity洗滌：PBS-0.05%Tween20洗3次BioengineeringCollegeDalianUniversity4℃，放置一周3封閉加入200μL/孔的3%脫脂奶粉1234AB5678910111212345678910111237℃，放置1hBioengineeringCollegeDalianUniversity封閉：是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。目的：抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。BioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶標板，甩干孔內(nèi)液體以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗滌3次洗滌：BioengineeringCollegeDalianUniversity4.加兔抗BSA抗體標記各孔，加入相應液體100μL/孔陰性陽性37℃，40min1234AB567891011121234567891011122004008001600……陰性陰性…………XXXX抗原+++-一抗+---二抗+-++一抗1234AB5678910111212342004008001600……一抗1234CD5678910111212342ul兔抗BSA抗體+198ulPBS100ul取100ul）100ul取100ul）100ul取100ul100ul取100ul）100ul取100ul）………BioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶標板，甩干孔內(nèi)液體以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗滌3次洗滌：BioengineeringCollegeDalianUniversity4.加二抗：各孔加入酶標羊抗兔IgG100μL/孔（4000倍稀釋）37℃，40minBioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶標板，甩干孔內(nèi)液體以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗滌3次洗滌：BioengineeringCollegeDalianUniversity

顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。BioengineeringCollegeDalianUniversity5.顯色：加入底物溶液100μL/孔避光顯色，37℃10-20min底物溶液:

鄰苯二胺（OPD）10mg

0.1M檸檬酸6.1ml

0.2MNa2HPO46.4ml

蒸餾水12.5ml

攪拌10min臨用前加入30%H2O24ul每組分2.5mlBioengineeringCollegeDalianUniversity陰性對照(negativecontrol)1，不加抗原孔

2，不加一抗孔

3，不加二抗孔陽性對照(positivecontrol)7.觀察結果6.終止反應加入50ul/孔2MH2SO4取出包被好抗原的酶標板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次4.加兔抗BSA抗體標記各孔，加入相應液體100μL/孔1234陰性空白陽性待測4.加二抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標二抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結果Bioengi