Cry9蛋白嵌合體的構(gòu)建與功能分析

圖9所示：圖SEQ圖\*ARABIC9CPY21和CPY22瓊脂糖凝膠結(jié)果圖注：A：CPY21重組子電泳圖；泳道1：cry9Eb-cry9Aa嵌合質(zhì)粒；泳道2：pET28a質(zhì)粒；泳道3：cry9EbN和M端；泳道4：cry9AaC端；泳道5：cry9Eb-cry9Aa嵌合酶切；B：CPY22重組子電泳圖；泳道1：cry9EbC端；泳道2：cry9AaNM端；泳道3:pET28a質(zhì)粒；泳道4：cry9Aa-cry9Eb嵌合質(zhì)粒；泳道5：cry9Aa-cry9Eb質(zhì)粒嵌合酶切。Cry9-like嵌合基因的表達(dá)與純化在本研究中，為了表達(dá)CPY21和CPY22蛋白，首先將含有相應(yīng)基因的菌株進(jìn)行過夜活化。隨后，分別取100μL活化后的菌液轉(zhuǎn)接至100mL含有Kan抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，并在37℃、180rpm的條件下培養(yǎng)1.5-2小時(shí)。當(dāng)菌液的光密度（OD600）達(dá)到0.6時(shí)，分別加入0.3mM和0.4mM的IPTG，以誘導(dǎo)CPY21和CPY22蛋白的表達(dá)。接著，在16℃的低溫條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)16-18小時(shí)，以確保蛋白的充分表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPY21和CPY22蛋白均為可溶性蛋白。進(jìn)一步的電泳分析顯示，表達(dá)的CPY21和CPY22蛋白的條帶大小均在75-95kDa左右，與蛋白分子量大小的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，從而驗(yàn)證了蛋白表達(dá)的準(zhǔn)確性。圖SEQ圖\*ARABIC10CPY21、CPY22蛋白SDS電泳圖Cry9-like蛋白的生物活性測(cè)定使用可溶性毒素蛋白CPY21、CPY22對(duì)甜菜夜蛾、棉鈴蟲、草地貪夜蛾和玉米螟進(jìn)行了生物活性的測(cè)定，測(cè)試結(jié)果表明嵌合蛋白對(duì)上述蟲子幾乎都沒有活性。表SEQ表\*ARABIC16毒素蛋白生物活性測(cè)定毒素蛋白玉米螟草地貪夜蛾棉鈴蟲甜菜夜蛾CPY21NANANANACPY22NANANANA注：“A”表示具有生物活性；“NA”表示沒有生物活性。結(jié)論長期過度使用化學(xué)農(nóng)藥已造成嚴(yán)重的環(huán)境污染與人畜受害問題，同時(shí)害蟲對(duì)常規(guī)防治手段的抗性也在逐漸增強(qiáng)。因此，以Bt為代表的生物防治手段逐漸受到廣泛關(guān)注。然而，長期使用單一基因進(jìn)行害蟲防治使得害蟲對(duì)現(xiàn)有抗蟲基因產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)日益上升，這對(duì)Bt殺蟲蛋白的未來應(yīng)用構(gòu)成了巨大的威脅。為了有效阻止或延緩昆蟲抗性的產(chǎn)生，挖掘新型殺蟲基因資源或采用基因疊加策略成為了重要的解決途徑ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>徐卓吟</Author><Year>2016</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[30]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0a2e00xs5svdxjevd9m5r9t92wzf2tw0x52f"timestamp="1713506146">24</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>徐卓吟</author><author>樓楊</author><author>張俊</author></authors></contributors><auth-address>福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院;福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院;</auth-address><titles><title>Bt毒素的改造策略</title><secondary-title>農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技</secondary-title></titles><periodical><full-title>農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技</full-title></periodical><pages>275-276</pages><volume>27</volume><number>16</number><keywords><keyword>Bt</keyword><keyword>截?cái)喽舅?lt;/keyword><keyword>噬菌體展示</keyword><keyword>PACE技術(shù)</keyword></keywords><dates><year>2016</year></dates><isbn>1007-7103</isbn><urls><related-urls><url>/kcms2/article/abstract?v=KPcMkpFoYBB6BLUCmUtbfl8vmAcgzKmen9ViKPCXj3bwvTRqjmDzFQRFupBgoLLwK4g6qj_GsuPPp1-3e5RCYy1DNY3tAP6TRNsq7zlnK7M1lbnVwzJDfNPHts5KF1ZryGphA8i3mVYc53ZOVVX3aA==&uniplatform=NZKPT&language=CHS</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[30]。本研究首先通過廣泛的微生物資源篩選，成功從土壤中分離出具有高效殺蟲活性的BtZ197-2菌株。這一菌株對(duì)小菜蛾和玉米螟等鱗翅目害蟲表現(xiàn)出顯著的殺蟲效果，為我們后續(xù)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。通過二代與三代全基因組測(cè)序技術(shù)的綜合運(yùn)用，我們深入剖析了BtZ197-2菌株的基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)編碼殺蟲蛋白的基因，其中就包括我們重點(diǎn)關(guān)注的Cry9類殺蟲蛋白。Cry9類殺蟲蛋白作為一種新型的殺蟲蛋白，其與應(yīng)用廣泛的Cry1和Cry2蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)存在顯著差異，這為我們解決害蟲抗性問題提供了新的思路。為了進(jìn)一步提升其殺蟲活性和拓寬殺蟲譜，我們嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)對(duì)Cry9基因進(jìn)行改造。通過設(shè)計(jì)特異性引物，我們?cè)隗w外成功擴(kuò)增出目的片段，并采用多片段克隆技術(shù)構(gòu)建了嵌合基因。隨后，這些基因被轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行體外表達(dá)，以獲取殺蟲蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了生物活性測(cè)定。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過改造的CPY21與CPY22嵌合蛋白對(duì)所測(cè)定的昆蟲活性并不強(qiáng)。這提示我們，單純的基因結(jié)構(gòu)域置換可能并不足以顯著提升殺蟲蛋白的活性。我們深知，殺蟲蛋白的殺蟲機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及到蛋白與害蟲腸道細(xì)胞的相互作用、蛋白的空間構(gòu)象變化以及其與受體的結(jié)合等多個(gè)環(huán)節(jié)。因此，我們需要更深入地理解這些環(huán)節(jié)之間的相互作用機(jī)制，才能更有效地進(jìn)行基因改造和蛋白優(yōu)化。盡管初步的生物活性測(cè)定結(jié)果并未達(dá)到預(yù)期效果，但本研究為后續(xù)基因改造和毒素蛋白的優(yōu)化提供了重要的參考價(jià)值和方向指引。首先，我們可以嘗試對(duì)其他類型的殺蟲蛋白進(jìn)行類似的基因改造和嵌合實(shí)驗(yàn)，以尋找更具活性的殺蟲蛋白。其次，我們可以通過定點(diǎn)突變、飽和突變等技術(shù)手段對(duì)現(xiàn)有的殺蟲蛋白進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，以進(jìn)一步提升其殺蟲活性和穩(wěn)定性。此外，我們還可以考慮將多種殺蟲蛋白進(jìn)行基因堆疊，以同時(shí)表達(dá)多種殺蟲蛋白來增強(qiáng)防治效果并降低害蟲產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)。除了上述的實(shí)驗(yàn)研究外，本研究還強(qiáng)調(diào)了多策略并行在害蟲防治中的重要性。在實(shí)際應(yīng)用中，我們可以將生物防治與其他防治方法相結(jié)合，如物理防治、化學(xué)防治以及農(nóng)業(yè)防治等，以形成綜合的害蟲防治體系。這種多策略的防治方法不僅能夠提高防治效果，還能夠降低對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)害蟲的選擇壓力，從而延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。綜上所述，本研究通過綜合運(yùn)用微生物資源篩選、基因組分析、基因工程技術(shù)和生物活性測(cè)定等手段深入探索了新型BtZ197-2菌株及其所含的Cry9類殺蟲蛋白在害蟲防治中的應(yīng)用潛力。盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未完全達(dá)到預(yù)期效果但我們從這一研究中獲得了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)為后續(xù)的研究提供了重要的參考和啟示。我們相信隨著研究的深入進(jìn)行我們將能夠開發(fā)出更高效、更環(huán)保的害蟲防治方法為我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)ADDINEN.REFLIST[1]顧曉峰,陰啟星,孫興民,張娓娓,和王曉鋒,蘇云金桿菌的分類研究綜述.現(xiàn)代園藝43(2020)11-12.[2]金嘉鳳,沈成,孟萌,陳蔚,徐重新,劉媛,和劉賢金,蘇云金芽孢桿菌Cry毒素共性結(jié)構(gòu)短肽串聯(lián)表達(dá)及功能分析.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)53(2024)96-104.[3]VanFrankenhuyzenK.,GringortenL.,andGauthierD.,Cry9Ca1Toxin,aBacillusthuringiensisInsecticidalCrystalProteinwithHighActivityagainsttheSpruceBudworm(Choristoneurafumiferana).Appliedandenvironmentalmicrobiology63(1997)4132-4.[4]陳喆,蘇云金芽孢桿菌分泌型殺蟲蛋白Vip3Aa及Sip1Ab的構(gòu)效關(guān)系研究,2023.[5]黃慧敏,曾遠(yuǎn)婷,和王磊,蘇云金芽孢桿菌及其伴孢晶體殺蟲劑研究進(jìn)展.廣東化工48(2021)86-87.[6]BravoA.,GillS.S.,andSoberónM.,ModeofactionofBacillusthuringiensisCryandCyttoxinsan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