Cry9蛋白嵌合體的構(gòu)建與功能分析

圖9所示：圖SEQ圖\*ARABIC9CPY21和CPY22瓊脂糖凝膠結(jié)果圖注：A：CPY21重組子電泳圖；泳道1：cry9Eb-cry9Aa嵌合質(zhì)粒；泳道2：pET28a質(zhì)粒；泳道3：cry9EbN和M端；泳道4：cry9AaC端；泳道5：cry9Eb-cry9Aa嵌合酶切；B：CPY22重組子電泳圖；泳道1：cry9EbC端；泳道2：cry9AaNM端；泳道3:pET28a質(zhì)粒；泳道4：cry9Aa-cry9Eb嵌合質(zhì)粒；泳道5：cry9Aa-cry9Eb質(zhì)粒嵌合酶切。Cry9-like嵌合基因的表達與純化在本研究中，為了表達CPY21和CPY22蛋白，首先將含有相應基因的菌株進行過夜活化。隨后，分別取100μL活化后的菌液轉(zhuǎn)接至100mL含有Kan抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，并在37℃、180rpm的條件下培養(yǎng)1.5-2小時。當菌液的光密度（OD600）達到0.6時，分別加入0.3mM和0.4mM的IPTG，以誘導CPY21和CPY22蛋白的表達。接著，在16℃的低溫條件下誘導培養(yǎng)16-18小時，以確保蛋白的充分表達。實驗結(jié)果表明，CPY21和CPY22蛋白均為可溶性蛋白。進一步的電泳分析顯示，表達的CPY21和CPY22蛋白的條帶大小均在75-95kDa左右，與蛋白分子量大小的預測結(jié)果相一致，從而驗證了蛋白表達的準確性。圖SEQ圖\*ARABIC10CPY21、CPY22蛋白SDS電泳圖Cry9-like蛋白的生物活性測定使用可溶性毒素蛋白CPY21、CPY22對甜菜夜蛾、棉鈴蟲、草地貪夜蛾和玉米螟進行了生物活性的測定，測試結(jié)果表明嵌合蛋白對上述蟲子幾乎都沒有活性。表SEQ表\*ARABIC16毒素蛋白生物活性測定毒素蛋白玉米螟草地貪夜蛾棉鈴蟲甜菜夜蛾CPY21NANANANACPY22NANANANA注：“A”表示具有生物活性；“NA”表示沒有生物活性。結(jié)論長期過度使用化學農(nóng)藥已造成嚴重的環(huán)境污染與人畜受害問題，同時害蟲對常規(guī)防治手段的抗性也在逐漸增強。因此，以Bt為代表的生物防治手段逐漸受到廣泛關(guān)注。然而，長期使用單一基因進行害蟲防治使得害蟲對現(xiàn)有抗蟲基因產(chǎn)生抗性的風險日益上升，這對Bt殺蟲蛋白的未來應用構(gòu)成了巨大的威脅。為了有效阻止或延緩昆蟲抗性的產(chǎn)生，挖掘新型殺蟲基因資源或采用基因疊加策略成為了重要的解決途徑ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>徐卓吟</Author><Year>2016</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[30]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0a2e00xs5svdxjevd9m5r9t92wzf2tw0x52f"timestamp="1713506146">24</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>徐卓吟</author><author>樓楊</author><author>張俊</author></authors></contributors><auth-address>福建農(nóng)林大學生命科學學院;福建農(nóng)林大學植物保護學院;福建農(nóng)林大學林學院;</auth-address><titles><title>Bt毒素的改造策略</title><secondary-title>農(nóng)村經(jīng)濟與科技</secondary-title></titles><periodical><full-title>農(nóng)村經(jīng)濟與科技</full-title></periodical><pages>275-276</pages><volume>27</volume><number>16</number><keywords><keyword>Bt</keyword><keyword>截斷毒素</keyword><keyword>噬菌體展示</keyword><keyword>PACE技術(shù)</keyword></keywords><dates><year>2016</year></dates><isbn>1007-7103</isbn><urls><related-urls><url>/kcms2/article/abstract?v=KPcMkpFoYBB6BLUCmUtbfl8vmAcgzKmen9ViKPCXj3bwvTRqjmDzFQRFupBgoLLwK4g6qj_GsuPPp1-3e5RCYy1DNY3tAP6TRNsq7zlnK7M1lbnVwzJDfNPHts5KF1ZryGphA8i3mVYc53ZOVVX3aA==&uniplatform=NZKPT&language=CHS</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[30]。本研究首先通過廣泛的微生物資源篩選，成功從土壤中分離出具有高效殺蟲活性的BtZ197-2菌株。這一菌株對小菜蛾和玉米螟等鱗翅目害蟲表現(xiàn)出顯著的殺蟲效果，為我們后續(xù)的研究奠定了堅實基礎(chǔ)。通過二代與三代全基因組測序技術(shù)的綜合運用，我們深入剖析了BtZ197-2菌株的基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了多個編碼殺蟲蛋白的基因，其中就包括我們重點關(guān)注的Cry9類殺蟲蛋白。Cry9類殺蟲蛋白作為一種新型的殺蟲蛋白，其與應用廣泛的Cry1和Cry2蛋白的受體結(jié)合位點存在顯著差異，這為我們解決害蟲抗性問題提供了新的思路。為了進一步提升其殺蟲活性和拓寬殺蟲譜，我們嘗試利用基因工程技術(shù)對Cry9基因進行改造。通過設(shè)計特異性引物，我們在體外成功擴增出目的片段，并采用多片段克隆技術(shù)構(gòu)建了嵌合基因。隨后，這些基因被轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中進行體外表達，以獲取殺蟲蛋白，并對其進行了生物活性測定。然而，實驗結(jié)果表明，經(jīng)過改造的CPY21與CPY22嵌合蛋白對所測定的昆蟲活性并不強。這提示我們，單純的基因結(jié)構(gòu)域置換可能并不足以顯著提升殺蟲蛋白的活性。我們深知，殺蟲蛋白的殺蟲機制是一個復雜的生物學過程，涉及到蛋白與害蟲腸道細胞的相互作用、蛋白的空間構(gòu)象變化以及其與受體的結(jié)合等多個環(huán)節(jié)。因此，我們需要更深入地理解這些環(huán)節(jié)之間的相互作用機制，才能更有效地進行基因改造和蛋白優(yōu)化。盡管初步的生物活性測定結(jié)果并未達到預期效果，但本研究為后續(xù)基因改造和毒素蛋白的優(yōu)化提供了重要的參考價值和方向指引。首先，我們可以嘗試對其他類型的殺蟲蛋白進行類似的基因改造和嵌合實驗，以尋找更具活性的殺蟲蛋白。其次，我們可以通過定點突變、飽和突變等技術(shù)手段對現(xiàn)有的殺蟲蛋白進行精細調(diào)控，以進一步提升其殺蟲活性和穩(wěn)定性。此外，我們還可以考慮將多種殺蟲蛋白進行基因堆疊，以同時表達多種殺蟲蛋白來增強防治效果并降低害蟲產(chǎn)生抗性的風險。除了上述的實驗研究外，本研究還強調(diào)了多策略并行在害蟲防治中的重要性。在實際應用中，我們可以將生物防治與其他防治方法相結(jié)合，如物理防治、化學防治以及農(nóng)業(yè)防治等，以形成綜合的害蟲防治體系。這種多策略的防治方法不僅能夠提高防治效果，還能夠降低對環(huán)境的污染和對害蟲的選擇壓力，從而延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。綜上所述，本研究通過綜合運用微生物資源篩選、基因組分析、基因工程技術(shù)和生物活性測定等手段深入探索了新型BtZ197-2菌株及其所含的Cry9類殺蟲蛋白在害蟲防治中的應用潛力。盡管實驗結(jié)果并未完全達到預期效果但我們從這一研究中獲得了寶貴的經(jīng)驗和教訓為后續(xù)的研究提供了重要的參考和啟示。我們相信隨著研究的深入進行我們將能夠開發(fā)出更高效、更環(huán)保的害蟲防治方法為我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展做出更大的貢獻。參考文獻ADDINEN.REFLIST[1]顧曉峰,陰啟星,孫興民,張娓娓,和王曉鋒,蘇云金桿菌的分類研究綜述.現(xiàn)代園藝43(2020)11-12.[2]金嘉鳳,沈成,孟萌,陳蔚,徐重新,劉媛,和劉賢金,蘇云金芽孢桿菌Cry毒素共性結(jié)構(gòu)短肽串聯(lián)表達及功能分析.河南農(nóng)業(yè)科學53(2024)96-104.[3]VanFrankenhuyzenK.,GringortenL.,andGauthierD.,Cry9Ca1Toxin,aBacillusthuringiensisInsecticidalCrystalProteinwithHighActivityagainsttheSpruceBudworm(Choristoneurafumiferana).Appliedandenvironmentalmicrobiology63(1997)4132-4.[4]陳喆,蘇云金芽孢桿菌分泌型殺蟲蛋白Vip3Aa及Sip1Ab的構(gòu)效關(guān)系研究,2023.[5]黃慧敏,曾遠婷,和王磊,蘇云金芽孢桿菌及其伴孢晶體殺蟲劑研究進展.廣東化工48(2021)86-87.[6]BravoA.,GillS.S.,andSoberónM.,ModeofactionofBacillusthuringiensisCryandCyttoxinsandtheirpotentialforinsectcontrol.Toxicon:officialjournaloftheInternationalSocietyonToxinology49(2007)423-35.[7]張文飛,蘇云金芽孢桿菌殺蟲成分的多樣性及其殺蟲機理,2005熱帶亞熱帶微生物資源的遺傳多樣性與基因發(fā)掘利用研討會,中國海南三亞,2005,pp.7.[8]劉婷婷,王英,鄭丹,劉治隆,李昕,王靜,和于莎莎,不同溫度下蘇云金桿菌對白紋伊蚊的殺蟲效果研究.中國熱帶醫(yī)學23(2023)1260-1265.[9]徐重新,金嘉鳳,孫曉明,沈成,張霄,陳澄宇,劉賢金,和劉媛,基于Bt毒素的殺蟲蛋白理性設(shè)計與創(chuàng)新應用策略.中國農(nóng)業(yè)科學57(2024)96-125.[10]FerryN.,EdwardsM.G.,GatehouseJ.,CapellT.,ChristouP.,andGatehouseA.M.,Transgenicplantsforinsectpestcontrol:aforwardlookingscientificperspective.Transgenicresearch15(2006)13-9.[11]RohJ.Y.,ChoiJ.Y.,LiM.S.,JinB.R.,andJeY.H.,Bacillusthuringiensisasaspecific,safe,andef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