氨氮脅迫對中華條頸龜腦內神經(jīng)遞質及其受體和轉運體的影響

II(TliRNaseHPlus)(2×)10.0PCRForwardprimer(10μM)0.8PCRReverseprimer(10μM)0.8DNA模板（<100ng）2.0dH2O(滅菌蒸餾水)6.4Total20.02.8ELISA檢測腦組織中神經(jīng)遞質(Glu、5-HT)的含量（1）檢測原理在實驗過程中，我們采用了雙抗體一步夾心法ELISA試劑盒，這是一種高效的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法。首先，我們將預先包被谷氨酸抗體的微孔板準備好，按照指定的順序依次加入標本、標準品和HRP標記的檢測抗體。接著，經(jīng)過嚴格的溫育和充分清洗步驟，確保實驗環(huán)境的純凈和穩(wěn)定。隨后，添加底物TMB進行顯色反應，觀察到TMB在過氧化物酶的作用下由藍色轉變?yōu)樽罱K的黃色。樣品中的谷氨酸含量與顯色的深淺呈正相關，這為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供了重要依據(jù)。最后，我們使用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值（OD值），并根據(jù)標準曲線計算出樣品的濃度，從而獲得準確的實驗結果。（2）操作方法在實驗室里，精密的操作是必不可少的。將腦組織倒入生理鹽水中，并進行精細的搗碎，確保每個細胞都被充分釋放出來。經(jīng)過3000轉的離心和10min的處理后，取出上清液，這是我們后續(xù)實驗的重要材料。鋁箔袋中的板條經(jīng)過室溫平衡后，被小心地取出，這些板條將是我們實驗中關鍵的樣本。剩余的板條則被保存在4℃的環(huán)境中，確保它們的新鮮度和完整性。接著，在實驗中設置不同的孔，準備標準品和樣本。標準品孔里加入不同濃度的標準品，每個孔都精確地加入50μL。而樣本孔中，則先加入待測樣本的10μL，再加入40μL的樣本稀釋液，確保樣本濃度的準確性?？瞻卓讋t不添加任何材料，作為對照。在進行酶聯(lián)免疫吸附測定實驗時，除空白孔外，每個標準品孔和樣本孔中都添加了100μL辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體。然后，使用封板膜密封反應孔，將樣品置于37℃水浴鍋或恒溫箱中溫育60min。之后，將液體倒掉，并用吸水紙將孔內殘余液體吸干凈。接著，每個孔中加入洗滌液，靜置1分鐘后甩去洗滌液，并再次用吸水紙吸干凈，共重復洗板5次。接下來，每個孔中分別添加底物A和底物B各50μL，避光情況下在37℃條件下孵育15分鐘。隨后倒入終止液50μL，在15分鐘內需要在450nm波長處測定各孔的OD值。檢測結果（子科生物ELISA代測實驗報告）標準曲線分析：谷氨酸（Glu）x0.0530.20.2510.3620.8951.741y036122448mg/L標準曲線分析：5-羥色胺(5-HT)x0.0430.1210.270.4890.7651.553y02550100200400ng/mL2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析在本研究中，采用SPSS26軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，將結果以均值±標準差（X±SD）的形式進行呈現(xiàn)。然后，進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，以確保數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計要求。下一步，通過單因素方差進行統(tǒng)計分析，以探究實驗組與對照組之間的差異。在差異性比較過程中，運用鄧肯法對照組和實驗組，以及實驗中的各組之間進行顯著性比較。最后，通過確定P值是否小于0.05來判斷各組之間是否存在顯著性差異。最后一步，利用GraphPadPrism5進行數(shù)據(jù)可視化呈現(xiàn)，以直觀展示實驗結果。整個過程旨在客觀評估各組數(shù)據(jù)間的關系，深入分析實驗結果并得出科學結論。3結果3.1谷氨酸含量氨氮脅迫分別處理24h、48h,實驗A100、A200組中華條頸龜腦內谷氨酸含量與對照組中的谷氨酸含量變化差異顯著（P<0.05)，并且隨著脅迫濃度的升高，實驗結果顯示，含量呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。在實驗A100組和實驗A200組之間的比較中，并未觀察到顯著性差異（P>0.05）。這表明在當前實驗條件下，不同處理組之間的影響并不顯著(P>0.05）。如圖1所示：圖1神經(jīng)遞質谷氨酸（Glu)含量Fig.1levelsoftheneurotransmitterglutamate(Glu)注：不同小寫字母（a、b和c）表示同一時間點不同氨氮濃度組之間的顯著差異3.25-羥色胺含量氨氮脅迫24h、48h后，實驗A100、A200組的5-羥色胺含量與對照組的5-羥色胺含量相比變化差異不顯著(P>0.05)，但也隨著脅迫濃度的升高，含量也表現(xiàn)出微小的上升趨勢。如圖2所示：圖2神經(jīng)遞質5-羥色胺（5-HT）含量Fig.2levelsoftheneurotransmitter5-hydroxytryptamine(5-HT)3.3谷氨酸受體基因mRNA表達量經(jīng)氨氮脅迫24h、48h后，實驗A100、A200組的谷氨酸受體基因（GRIN2B）mRNA表達量與對照組相比GRIN2BmRNA表達水平上調，均存在顯著性差異（P<0.05),且兩實驗組在48h顯著升高并達到最高水平（如圖3A）。氨氮脅迫24h、48h后，實驗A100、A200組的谷氨酸受體基因（GRIA2）mRNA相對表達量隨著氨氮濃度的升高也在不斷上升，實驗A100、A200組的GRIA2mRNA相對表達量與對照組相比差異均顯著（P<0.05)（如圖3B)，且實驗A100、A200組在48h顯著升高并達到最高水平。圖3神經(jīng)遞質谷氨酸受體基因（GRIN2B、GRIA2）mRNA表達量Fig.3mRNAexpressionoftheneurotransmitterglutamatereceptorgenes(GRIN2B,GRIA2)圖3A：N-甲基-D-天冬氨酸受體2B(GRIN2B)mRNA表達圖3B：谷氨酸離子型受體AMPA亞基2(GRIA2)mRNA表達3.4谷氨酸轉運體基因mRNA表達量經(jīng)氨氮脅迫48h后，實驗A100、A200組的谷氨酸轉運體基因（GLT-1）mRNA表達水平隨著氨氮濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，與對照組相比均存在顯著性差異（P<0.05),且兩實驗組均在48h顯著下降并達到最高水平（如圖5A）。在脅迫48h，A100組和A200組谷氨酸轉運體基因（GLAST）mRNA相對表達量與對照組相比均差異顯著（P<0.05)，且兩實驗組均在48h顯著下降并達到最高水平（如圖5B）。圖4神經(jīng)遞質谷氨酸轉運體基因（GLT-1、GLAST）mRNA表達量Fig.4mRNAexpressionofglutamatetransportergenes(GLT-1,GLAST)圖4A：谷氨酸轉運體1(GLT-1)mRNA表達圖4B：谷氨酸天冬氨酸轉運體(GLAST)mRNA表達3.55-羥色胺受體基因（5-HT受體）和轉運基因（SLC6A4）mRNA表達量氨氮脅迫24h、48h后，實驗A100、A200組的5-HT受體mRNA相對表達量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）（如圖5A）。實驗A100、A200組的5-羥色胺轉運體（SLC6A4）mRNA相對表達量與對照組相比差異不顯著（P>0.05)（如圖5B），48h后5-羥色胺轉運基因（SLC6A4）與對照組相比雖存在微量的上升，但沒有顯著性差異，而且各組之間不存在顯著性差異。圖55-羥色胺受體基因（5-HT受體）和轉運體基因（SLC6A4）mRNA表達量Fig.5serotoninantagonistgene(5-HTreceptor)andtransportergene(SLC6A4)mRNAexpressionlevels圖5A：5-羥色胺受體（5-HT）mRNA表達圖5B：5-羥色胺轉運體(SLC6A4)mRNA表達4討論參與信息處理的主要細胞是神經(jīng)元，神經(jīng)元之間傳遞信息的各種化學物質被稱為神經(jīng)遞質它發(fā)揮著關鍵的支持作用[31]。神經(jīng)遞質受體和其他蛋白質參與神經(jīng)遞質合成和失活至關重要，在醫(yī)學上常用來治療精神疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病和許多其他問題[32]。許多神經(jīng)遞質及其相對應的受體和轉運體在結構和功能上可能是完全不同的，并不是所有釋放出來的神經(jīng)遞質分子都能找到一個可以結合的受體，因為決定功能的是受體而不是神經(jīng)遞質。本研究將利用qPCR和雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的方法，測定中華條頸龜腦內神經(jīng)遞質谷氨酸（Glu)含量、5-羥色胺（5-HT）含量、神經(jīng)遞質受體基因包括谷氨酸受體基因（GRIN2B）和（GRIA2）mRNA相對表達量，及其轉運體包括谷氨酸天冬氨酸轉運體（GLAST）、谷氨酸轉運體1（GLT-1），還有5-羥色胺受體（5-HT受體）和5-羥色胺轉運體（SLC6A4）mRNA相對表達量，探究氨氮濃度對中華條頸龜腦內神經(jīng)遞質含量和神經(jīng)遞質受體及其轉運體等的影響，對于進一步了解水體環(huán)境中氨氮脅迫對龜類的毒性機制有一定的幫助。谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種最重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質，主要分布于大腦皮質、海馬、小腦和紋狀體，在學習及大腦發(fā)育等方面均起重要作用[33-34]。中樞神經(jīng)遞質主要包括單胺類神經(jīng)遞質、氨基酸類神經(jīng)遞質、肽類及其他類[35]。谷氨酸（Glu)和5-羥色胺（5-HT）及其代謝產物是中樞神經(jīng)遞質中非常重要的神經(jīng)遞質，也是動物大腦中非常重要的神經(jīng)傳遞物質，共同參與人和動物生理活動及心理活動等的調節(jié)[36]。Glu水平主要受谷氨酸/天冬氨酸轉運蛋白（GLAST）和Glu轉運蛋白-1（GLT-1）調節(jié)[37-38]。在體內的谷氨酸循環(huán)平衡主要由谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺酶（GLS）、GLAST和GLT-1維持[39]。GLAST和GLT-1負責從突觸裂隙中去除過量的Glu以防止興奮性毒性神經(jīng)元死亡[40]。而在病理條件下，谷氨酸興奮性毒性會導致細胞體積失調和腫脹，而主要可能通過過度激活的NMDA型谷氨酸受體，同時伴有水的流入，從而使得腦組織損傷[41]。過多的谷氨酸(Glu)被釋放，與N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA)結合，最終導致興奮性毒性[29,30,42]。在本研究中，經(jīng)氨氮脅迫24h和48h后中華條頸龜腦內神經(jīng)遞質Glu含量顯著高于對照組（P<0.05）；在實驗中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸轉運體基因（GLT-1）mRNA表達水平在氨氮濃度逐漸升高的情況下呈現(xiàn)出遞減的趨勢。與對照組相比，實驗組的差異性顯著(P<0.05)，且在48小時內兩組均表現(xiàn)出明顯下降并達到最高水平。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了對于氨氮濃度對GLT-1基因表達的影響的深入思考。或許在不同氨氮濃度下，GLT-1基因的表達會呈現(xiàn)出不同的調節(jié)模式，這也許可以解釋為什么在實驗中觀察到了如此顯著的差異性。未來的研究或許可以進一步探究氨氮濃度對GLT-1基因表達的影響機制，以期為相關疾病的治療提供更多的啟示。而GRIN2BmRNA相對表達量卻隨著氨氮濃度的升高呈現(xiàn)出一定的上升趨勢，在A2-48h顯著升高并達到最高水平(P<0.05）。這表明氨氮可能導致中華條頸龜腦內谷氨酸能紊亂，促使興奮性神經(jīng)毒性產生，最終導致其腦組織損傷。5-HT神經(jīng)元胞體主要位于腦干的中縫核，其未梢則廣泛分布在腦和脊髓中[42]。5-HT必須與受體結合才能發(fā)揮作用[43]。5-HT受體參與下的5-HT的釋放或再吸收可能引起多種藥理作用，5-HT受體的多樣性導致了5-HT神經(jīng)遞質系統(tǒng)的復雜性。5-羥色胺受體（5-HT）和5-羥色胺轉運體（SLC6A4）在調節(jié)細胞外5-HT的過程發(fā)揮著關鍵作用[44]。本研究結果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過氨氮脅迫處理24小時和48小時后，實驗組中華條頸龜腦內的5-HT受體mRNA相對表達量相較于對照組并未出現(xiàn)顯著的差異。盡管脅迫組中的5-HT受體mRNA相對表達量呈現(xiàn)出微弱的上升趨勢，但這種變化與對照組相比并不顯著。在實驗組中，當氨氮濃度為200mg/L時，經(jīng)過48小時的脅迫處理，中華條頸龜腦內的SLC6A4mRNA相對表達量水平與對照組相比并無顯著差異。而當氨氮濃度為100mg/L時，雖然實驗組中的SLC6A4mRNA相對表達量相比對照組有微弱的上升，但這種變化同樣沒有達到顯著性的水平。這些結果暗示，氨氮脅迫對中華條頸龜腦內5-HT和SLC6A4mRNA的相對表達量并沒有產生顯著的影響。換句話說，中華條頸龜在面對氨氮脅迫時，其腦內5-HT和SLC6A4mRNA的表達可能具有一定的穩(wěn)定性或適應性，使得其能夠在一定程度上抵抗外界環(huán)境的壓力。這樣的穩(wěn)定性或適應性可能有助于中華條頸龜在面對氨氮脅迫時，保持其正常的生理功能和行為反應，從而更好地適應和生存于復雜多變的環(huán)境中。然而，具體的機制仍需進一步的研究和探討。表明氨氮脅迫會對中華條頸龜腦內5-HT和SLC6A4mRNA相對表達量沒有產生顯著性影響，說明了氨氮脅迫對于中華條頸龜腦內神經(jīng)遞質5-羥色胺及其受體和轉運體基因mRNA相對表達量影響均不顯著，沒有產生明顯影響。由此可知，高濃度氨氮環(huán)境下能夠通過干擾神經(jīng)遞質谷氨酸相應的受體和轉運體表達，影響谷氨酸的釋放和轉換，導致其神經(jīng)遞質的紊亂，最終引起其一系列反應。結論1、在本研究中，氨氮脅迫對中華條頸龜（Mauremyssinensis）腦內神經(jīng)遞質谷氨酸含量和5-羥色胺含量的影響中。發(fā)現(xiàn)在氨氮脅迫后神經(jīng)遞質5-羥色胺含量雖有上升但與CK組相比不明顯，且5-羥色胺含量各組之間沒有顯著性差異。而5-HT受體和SLC6A4mRNA相對表達量的影響中，5-HT受體及其轉運體（SLC6A4）mRNA相對表達量各處理組之間無顯著差異，這說明短期高濃度氨氮可能對中華條頸龜腦組織中5-HT神經(jīng)元的活性沒有影響，對其受體及轉運體基因mRNA相對表達量影響不顯著，進一步表明，短期高濃度氨可能不會影響中華條頸龜腦組織中5-HT神經(jīng)元的活性。2、在氨氮脅迫對于中華條頸龜腦內谷氨酸含量及其相關基因（GRIN2B、GRIA2、GLAST和GLT-1）mRNA相對表達量的影響中。發(fā)現(xiàn)在氨氮脅迫24h、48h后神經(jīng)遞質谷氨酸含量顯著高于CK組；GRIN2B和GRIA2mRNA相對表達量隨著氨氮濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，在A2-48h顯著升高并達到最高水平；GLT-1和GLASTmRNA表達水平隨著氨氮濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，在A2-48h與對照組顯著下降。這說明氨氮可能通過介導神經(jīng)遞質谷氨酸的相關受體基因和轉運體基因mRNA相對表達量的釋放和轉換，使其在腦組織內蓄積，致使其在腦內的平衡被打破，而谷氨酸過度激活其受體引起一系列連鎖反應，從而引起興奮性毒性，引起神經(jīng)遞質系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，最終導致中華條頸龜腦組織損傷。參考文獻姜志勇.我國淡水龜鱉類的種質資源研究[J].吉林畜牧獸醫(yī),2016,37(07):60-61.史海濤,洪美玲,傅麗容,等.龜類的養(yǎng)殖與保護[J].生物學報,2009,44(01):18-21.李丕鵬,莫燕妮,周婷,等.中國珍稀瀕危爬行動物資源——中華花龜[J].蛇志,2013,25(02):171-176.吳建軍.巴西彩龜繁殖生物學、孵化環(huán)境及稚龜生長的研究[D].湖南農業(yè)大學,2003.張蓉,鄧天龍,廖夢霞.水環(huán)境中氨氮的分析方法進展[J].四川環(huán)境,2008(01):76-80.劉娥.草幼魚對氨氮脅迫的形態(tài)及生理學響應[D].山東大學,2013.KooJG，KimSG，JeeJH，etal．Effectsofammoniaandnitriteonsurvival，growthandmoultinginjuveniletigercrab，Orithyiasinica(Linnaeu［J］．AquacultureＲesearch，2005，36(1):79－85．DeFreitasＲMＲodriguezEM，SantosEA，etal．HistopathologicalchangesingillsoftheestuarinecrabChasmagnathusgranulate(Crustacea－Decapoda)followingacuteexposuretoammonia［J］．ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartCToxicology＆Pharmacology，2000，125(2):157－164．齊茜,師順,黃勇等.氨氮脅迫對雜交鱘腦、鰓及血清的生理影響[J].河南科技大學學報(自然科學版),022,43(03):78-85+9.FelipoV,ButterworthRF.Neurobiologyofammonia.Prog.Neurobiol,2002,67:259–279.HazellAS.Excitotoxicmechanismsinstroke:Anupdateofconceptsandtreatmentstrategies[J].NeurochemistryInternational,2007,50(7-8):941-953.董玉波,賈甲,劉堯,等.氨態(tài)氮對水產動物毒性的研究概況[J].河北漁業(yè),2010,(06):42-45.張武肖,孫盛明,戈賢平,等.急性氨氮脅迫及毒后恢復對團頭魴幼魚鰓、肝和腎組織結構的影響[J].水產學報,2015,39(02):233-244.許星鴻,張雁秋,閻斌倫,等.氨氮脅迫對日本蟳免疫生理指標及器官結構的影響[J].生態(tài)學報,2014,34(14):3885-3894.洪美玲,陳立僑,顧順樟,等.氨氮脅迫對中華絨螯蟹免疫指標及肝胰腺組織結構的影響[J].中國水產科學,2007,(03):412-418.WicksBJ，JoensenＲ，TangQ，etal．Swimmingandammoniatoxicityinsalmonids:theeffectofsublethalammoniaexposureontheswimmingperformanceofcohosalmonandtheacutetoxicityofammoniainswimmingandrestingrainbowtrout［J］.AquaticToxicology，2002，59(1/2):55-69．姜令緒，潘魯青，肖國強．氨氮對凡納對蝦免疫指標的影響［J］．中國水產科學，2004，11(6):537-541．KasturiR,LutzA,PeterC.2006.AmmoniatoxicityanditseffectonthegrowthoftheSouthAfricanabaloneHaliotismidaeLinnaeus[J].AtmosphericChemistry&Physics,15(9):678-687.RebeloMF,SantosEA,MonserratJM.1999.AmmoniaexposureofChasmagnathusgranulata(CrustaceaDecapoda)Dana,1851:accumulateioninhaemolymphandeffectsonosmoregulati[J].CorrosionScience,122:429-435.RacottaIS,Hernndez-HerreraR.2000.Metabolicresponsesofthewhiteshrimp,Penaeusvannamei,toambientammonia[J].CompBiochemPhysiolAMolIntegr，Physiol,125(4):437-443.吳利敏，徐瑜鳳，李永婧，等．急性氨氮脅迫對淇河鯽幼魚腦、鰓、肝、腎組織結構的影響［Ｊ］．中國水產科學，2020，27（7）：789－800．陳思涵，彭瑞冰，黃晨，等．急性氨氮脅迫對虎斑烏賊肝臟、鰓和腦組織結構的影響［Ｊ］．水產學報，2018，42（9）：1348－1357．黃祖彬,梁齡月,李維昊,等.急性氨氮脅迫和恢復后中華條頸龜主要器官組織結構的變化[J].水產科學,2022,41(01):143-149.DOI:10.16378/ki.1003-1111.20173.FelipoV,ButterworthRF.Neurobiologyofammonia.Prog.Neurobiol,2002,67:259–279.RaoV.Nitricoxideinhepaticencephalopathyandhyperammonemia[J].NeurochemistryInternational,2002,41:161-170.CagnonL,BraissantO.Hyperammonemia-inducedtoxicityforthedevelopingcentralnervoussystem[J].BrainResRev,2007,56(1):183-97.HazellAS.Excitotoxicmechanismsinstroke:Anupdateofconceptsandtreatmentstrategies[J].NeurochemistryInternational,2007,50(7-8):941-953.PietraszekMa?gorzata,MichalukJ,IrenaRomańska,etal.1-Methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolineantagonizesariseinbraindopaminemetabolism,glutamatereleaseinfrontalcortexandlocomotorhyperactivityproducedbyMK-801butnotthedisruptionsofprepulseinhibition,andimpairmentofworkingmemoryinrat[J].NeurotoxicityResearch,2009,16(4):390-407.ShiW,LuY.MetabotropicglutamateandGABAreceptorsmodulatecellularexcitabilityandglutamatergictransmissioninchickencochlearnucleusangularisneurons[J].Hearingresearch,2017,346:14-24.王貞杰,陳四清,曹棟正,等.急性氨氮脅迫對圓斑星鰈(Veraspervariegatus)幼魚鰓和肝組織結構及相關酶活性的影響[J].漁業(yè)科學進展,2017,38(02):59-69.Trachtenberg,J.T.,Chen,B.E.,Knott,G.W.,Feng,G.,Sanes,J.R.,Welker,E.,Svobo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