奶?；铙w采卵技術規(guī)程

奶?；铙w采卵技術規(guī)程范圍本文件規(guī)定了奶?；铙w采卵技術中采卵室的基本要求、供體牛篩選與飼養(yǎng)管理、供體牛卵巢刺激前評估、供體牛卵巢刺激程序、活體采卵操作、卵母細胞分級鑒定的技術要求。本文件適用于奶牛活體采卵技術及其他相關領域的科研需求。規(guī)范性引用文件本標準采用下列術語和定義下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T26938-2011牛胚胎生產技術規(guī)程。T/DACS002-2021荷斯坦牛體型鑒定操作技術規(guī)范。術語和定義供體牛donor指提供優(yōu)質卵母細胞的良種母牛?；铙w采卵ovumpick-up（OPU）借助專用獸用超聲診斷儀，用陰道探頭、采卵針、連接系統(tǒng)和負壓泵直接從活體供體牛卵巢上抽吸卵泡液中包含未成熟卵母細胞的操作過程。卵巢刺激superstimulationOPU前，通過專用獸用超聲診斷儀和外源性激素，誘導供體牛卵巢發(fā)育更多卵泡，確保卵母細胞質量和適宜大小卵泡的比例，配合后續(xù)不同體外胚胎生產的操作方法。卵巢刺激與超數排卵不同，后者需誘導卵泡成功排卵，前者應盡可能保證卵泡以適宜大小存在于卵巢上并避免過度成熟。采卵室基本要求儀器OPU獸用超聲診斷儀：包括顯示器、OPU專用陰道探頭（128陣元、頻率5.5Hz～7.5Hz、適配各型號采卵針）、負壓泵（吸引壓力0kPa～25kPa、0mmHg～200mmHg），恒溫器（操作控溫范圍為38.5±1℃，適配收集管為50mL離心管）、血糖血酮儀。場地設施采卵室要求清潔安靜、明亮寬敞、溫度需8℃～25℃，配備有水電、置物臺及設置有防踢鏈的六柱欄保定架。藥品耗材所用藥品生產廠家應具備生產資質，試劑批號、編號須清晰，試劑和藥物應在保質期內并嚴格按照使用說明書貯存、取用和配置。藥品。獸用注射用促卵泡素（FSH）、注射用前列腺素F2α、孕酮陰道栓，血糖血酮儀試紙、2%鹽酸利多卡因、耦合劑、75%酒精、石蠟油、生理鹽水、新潔爾滅等。耗材。一次性采卵針（18G×24/5或1,2×70mm）、硅膠管（1.2mm×2.4mm）、注射器（10mL，20mL、50mL），長臂手套、乳膠手套、口罩、吸水衛(wèi)生紙等。供體牛篩選與飼養(yǎng)管理選拔適用對象青年母奶牛和成年母奶牛均可作為候選供體牛群體。選擇供體牛時，宜根據牧場育種目標、實際生產需要和基因組測序結果，選擇具有產奶量、長壽性、繁殖性能、健康度、適應性和抗逆性等優(yōu)良遺傳學價值的母牛。生產性能分析調取牧場DHI檢測、生產性能和繁殖、疾病治療等記錄。供體牛應滿足下列要求：健康狀況良好，排除遺傳性疾病與生殖器官疾?。荒戤a奶量14t以上，生產壽命高于4胎次；成年母牛應為2～4胎次、產后天數超過45d、卵巢機能已完全恢復；青年母牛應為9月齡以上、卵巢狀態(tài)發(fā)育良好并至少有1次完整的發(fā)情周期。線性鑒定參照T/DACS002-2021鑒定供體牛體型。荷斯坦奶牛共劃分5個部位：包括體軀容量（18%）、尻部（10%）、肢蹄（20%）、泌乳系統(tǒng)（42%）和乳用特征（10%），20個線性評分性狀和23個缺陷性狀。按體型鑒定得分劃分為6個等級：優(yōu)秀（EX，90～100）、很好（VG，85～89）、好+（G+，80～84）、好（G，75～79）、一般（F，65～74）和差（P，65分以下）。應選擇等級為“好+”及以上、無明顯體型缺陷的母牛作為供體牛。全基因組選擇全基因組測序應由商業(yè)化公司完成。操作人員應穿戴防護、確保血斑卡干凈無污染，奶牛耳號、血斑卡號和表格登錄號必須保持一致，規(guī)范制作測序血液樣本血斑卡：在空白的血斑卡背面標記牛號等信息，用5mL或10mL的一次性無菌注射器，從奶牛尾根部或頸部采集血液樣本1mL，立即將血樣滴加至血斑卡中心黑色圓圈內，完全覆蓋但不能超卡片；放置桌面自然晾干（約12h）。供體牛飼養(yǎng)確認供體牛后，宜單獨分群飼養(yǎng)。牧場實施常規(guī)管理，日糧配方平衡全面，保持合適體況，環(huán)境清潔安靜，飼養(yǎng)密度合理，運動適量。應建立和實施完善的防疫、生物安全制度，保證牛群無中毒風險。卵巢刺激前評估卵巢刺激程序前1天，應評估供體牛是否適合卵巢刺激和OPU操作。臨床檢查。檢查供體牛體溫、精神狀態(tài)、采食情況、瘤胃充盈度和糞便等情況，應重點檢查是否發(fā)生乳房炎、子宮炎、肺炎和腹瀉等炎性疾病。能量平衡狀態(tài)檢查。檢查供體牛近1周產奶量、評估近1天采食狀況，卵巢刺激前1天，采集血液樣本，檢測血糖和血β羥基丁酸水平。其中血糖值應為2.8mmol/L～4.5mmol/L，血β羥基丁酸應＜1.2mmol/L。溫順度評估。用牛毛刷評價供體牛溫順度：待奶牛處于頸夾時，用專用毛刷刺激其頸部、背部和尾根部，根據牛只反應評分：1分，奶牛無明顯反應；2分，奶牛輕微不安，躲避毛刷，但無攻擊性；3分，奶牛明顯不安，且表現(xiàn)攻擊性。供體牛應性格溫順，易接近、易驅趕，對操作人員無明顯攻擊性，對注射操作無過激反應。應優(yōu)先選擇評分為1分的奶牛，慎重選擇評分為2分的奶牛，盡量不選擇評分為3分的奶牛。卵巢刺激消除卵泡程序啟動時間。OPU供體牛篩選評估合格后，無需觀察或確定發(fā)情周期，選定任意一天即可啟動卵巢刺激程序。宜在下午啟動，減少夜間注射FSH次數并將采卵時間安排在上午。供體牛保定。供體牛實施頸夾保定。供體牛麻醉。一般情況不需麻醉。如供體牛煩躁不安、左右搖擺、直腸緊繃或努責，可于尾椎和薦椎結合處或第一和第二尾椎結合處注射2.5mL2%鹽酸利多卡因實施硬膜外腔麻醉。儀器準備。按照儀器操作說明，將硅膠管一端緊密連接一次性采卵針，保持采卵針頭無菌置入OPU專用陰道探頭針槽中，另一端連接負壓泵或一次性50mL注射器。負壓泵的負壓值應為60mmHg～110mmHg（或流速為20mL/min～30mL/min）。供體牛清潔消毒。刺激排糞或掏盡供體牛積糞，用0.1%新潔爾滅仔細清洗供體牛會陰處和外陰，并使用75%酒精消毒。超聲檢查。將連接好的OPU超聲診斷儀陰道探頭插入供體牛陰道，一手固定保持位置，另一手佩戴長臂手套伸入供體牛直腸，通過直腸把握卵巢，動作輕柔、雙手配合將卵巢間隔陰道穹隆貼于超聲探頭上。顯示器屏幕能清晰顯示卵巢狀態(tài)時，記錄卵巢狀態(tài)：有無黃體及其大小，2mm～5mm的卵泡數量，5mm以上的卵泡數量及卵巢囊腫或粘連等異常情況。采取同樣方式檢查并記錄另一側卵巢。抽吸消除卵泡。由專業(yè)人員參照顯示影像引導線，控制一次性采卵針刺入卵巢，抽吸全部＞5mm卵泡，應抽盡并避免出血，抽吸的卵泡液可棄掉，每頭供體牛抽取5mm以上卵泡不超過5個。儀器清洗。對下一頭供體牛操作前，應用0.1%新潔爾滅清洗陰道探頭，更換一次性采卵針，避免交叉感染。溶解黃體消除卵泡24h后，對存在黃體的供體牛肌肉注射單劑量PGF2α。以商品諦諾為例，注射5mL。無黃體的供體牛，省略此步驟。FSH刺激消除卵泡36h后，根據藥物說明書溶解或直接肌肉注射第1針FSH（注射劑量為167國際單位），隨后每間隔12h注射167國際單位FSH一次，共注射三次，總劑量500國際單位。選擇性放置孕酮陰道栓第1針FSH注射后，可選擇性放置孕酮陰道栓直至OPU前取出?；衅诘?針FSH注射完成后，不做任何處理，24h后實施OPU。程序總覽供體牛卵巢刺激程序共應操作4～5次，總時長84h（3.5d），操作時間誤差不超過±1h。保證OPU時可采集卵泡超過25個，且適宜大小卵泡（5mm～8mm）占比75%以上，可用卵母細胞（A級、B級和C級卵母細胞）占比90%以上。供體牛卵巢刺激程序卵巢刺激程序實施后效果OPU操作供體牛保定將供體牛無應激趕至?；铙w采卵室，用六柱欄保定架牢固保定，設置好防踢鏈子。供體牛麻醉應先掏去直腸內積糞，再于尾椎和薦椎結合處或第一和第二尾椎結合處注射5mL2%鹽酸利多卡因做硬膜外腔麻醉。儀器準備按照操作說明連接獸用OPU超聲診斷儀。將硅膠管一端緊密連接一次性采卵針（17G×600mm長針或18G短針）并保持針頭無菌，置入OPU專用陰道探頭的針槽中。另一端通過采卵收集管（50mL離心管）連接負壓泵，采卵收集管內提前加入5mL左右預熱好的卵母細胞保存液，負壓值設置為60mmHg～110mmHg（或流速為20mL/min～30mL/min），恒溫箱溫度設定為38℃±1℃。牛清潔消毒用0.1%新潔爾滅仔細清洗供體牛會陰處和外陰，并使用75%酒精消毒。OPU操作將連接好的獸用OPU超聲診斷儀陰道探頭插入供體奶牛陰道內，一手固定保持位置，另一手佩戴長臂手套伸入供體奶牛直腸，通過直腸把握卵巢，應動作輕柔、雙手配合將卵巢間隔陰道穹隆貼于超聲探頭上，顯示器能清晰顯示卵巢狀態(tài)時，調整探頭與卵巢的相對位置，選擇清晰可見的卵泡（大于2mm），推進采卵針，刺破卵泡壁時用開關控制負壓泵抽吸卵泡內容物至收集管中，記錄穿刺卵泡數量。采用同樣方法對另一側卵巢進行采集。沖洗管道待所有清晰可見的卵泡均被穿刺后，用采卵液沖洗采卵針和導管，連同沖洗液一同置于收集管中；迅速運送至實驗室。操作過程應保證溫度恒定。卵母細胞分級鑒定沖洗過濾使用20mL注射器將采集到的卵泡液緩慢加入集卵杯上方濾網中，蓋上蓋子傾斜過濾，隨后用38.5℃預熱的卵母細胞洗滌液潤洗收集管的管壁、蓋子和集卵杯蓋2～3次。多次用卵母細胞洗滌液緩慢沖洗集卵杯濾網四周直至采卵液清亮。卵母細胞收集在體視顯微鏡下，用檢胚管檢出卵丘顆粒細胞-卵母細胞復合物（COCs）。檢出時應盡量少攜帶液體，降低污染。洗卵檢出的COCs放入不同hepes中潤洗3～5次；在OM洗液中潤洗3～5次；在體外成熟液中潤洗1次后移到IVM卵滴中，置于三氣培養(yǎng)箱成熟培養(yǎng)。COCs等級劃分根據COCs外觀特征劃