DB32-T 4677-2024 周叢生物綜合調(diào)查與分析測試技術(shù)規(guī)程

CCSZ06江蘇省地方標準周叢生物綜合調(diào)查與分析測試技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofpracticeforsurvey，anal2024-02-05發(fā)布2024-03-05實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)發(fā)出布版Ⅰ前言 Ⅲ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4采樣點位布設(shè) 4.1布點原則 4.2布點前期準備 4.3布點要求 5樣品采集與保存 5.1材料和器具 5.2樣品采集 5.3樣品的處理與儲存 6物理指標分析測試 6.1覆蓋度測定 6.2厚度測定 6.3二維形態(tài)表征 6.4三維結(jié)構(gòu)表征 7化學指標分析測試 7.1總有機碳、總無機碳和總碳含量 7.2總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量 7.3磷含量 7.4鉀含量 7.5鈉含量 7.7硫含量 7.8鐵含量 7.9錳含量 7.10銅含量 7.11鋅含量 7.12鉬含量 7.13硅含量 7.14氯含量 Ⅱ7.15硼含量 8生物指標分析測試 8.1微生物組成和多樣性 8.2磷脂脂肪酸群落結(jié)構(gòu) 8.3胞外聚合物 8.4生物量 8.5葉綠素含量 附錄A（資料性）周叢生物采樣點位信息記錄表 附錄B（資料性）周叢生物原位采樣器 附錄C（資料性）周叢生物野外采樣記錄 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由全國土壤質(zhì)量標準化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：中國科學院南京土壤研究所、中國環(huán)境科學研究院、中國科學院水生生物研究所、河海大學、南京林業(yè)大學、中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學院。本文件主要起草人：吳永紅、孫朋飛、徐瀅、周蕾、劉俊琢、陸海鷹、李丹、王思楚、陳志浩、王凱、1DB32/T4677—2024周叢生物綜合調(diào)查與分析測試技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了周叢生物調(diào)查點位布設(shè)、樣品采集與保存以及物理、化學和生物指標分析測試的要求。本文件適用于稻田、溝渠、河流、水庫、湖泊等濕地或淺水水體中周叢生物采樣點的布設(shè)、采集、保存以及物理、化學和生物性質(zhì)的定量表征或測試分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T33834微束分析掃描電子顯微術(shù)生物試樣掃描電子顯微鏡分析方法DZ/T0279.27區(qū)域地球化學樣品分析方法第27部分：有機碳量測定重鉻酸鉀容量法HJ634土壤氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的測定氯化鉀溶液提取?分光光度法HJ897水質(zhì)葉綠素a的測定分光光度法HJ/T345水質(zhì)鐵的測定鄰菲啰啉分光光度法JY/T0586激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法通則LY/T1246森林土壤交換性鉀和鈉的測定LY/T1250森林土壤碳酸鈣的測定NY/T88土壤全磷測定法NY/T149土壤有效硼測定方法NY/T1378土壤氯離子含量的測定NY/T2017植物中氮、磷、鉀的測定NY/T3030棉花中水溶性總糖含量的測定蒽酮比色法SN/T3926出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1周叢生物periphyton淹水環(huán)境下附著生長于固體基質(zhì)表面的藻類、細菌、原生動物和后生動物等微生物及其代謝產(chǎn)物和2有機碎屑交織在一起形成的聚合體。周叢生物覆蓋度periphytoncoverage單位面積內(nèi)附著生長在基質(zhì)表面的周叢生物面積占總面積之比。注：一般用百分數(shù)表示。周叢生物粗糙度periphytonroughness周叢生物表面孔隙和空隙占整個體積的比例。周叢生物多樣性biodiversityofperiphyton周叢生物內(nèi)顯著不同的種群之間以及同一種群內(nèi)的遺傳變異，涉及周叢生物中多種多樣活的有機體（藻類、細菌、原生動物和后生動物）的種類、數(shù)量及其在周叢生物中的分布信息。周叢生物胞外聚合物extracellularpolymericsubstances（EPS)ofperiphyton在一定環(huán)境條件下由周叢生物內(nèi)細菌、微藻等微生物分泌于細胞外的主要由多糖、蛋白質(zhì)和核酸等組成的大分子聚合物。周叢生物生物量biomassofperiphyton某一時間段內(nèi)單位面積或單位體積內(nèi)周叢生物實存生活的有機物質(zhì)（干重）總量。注：通常用g/cm2或g/cm3表示。4采樣點位布設(shè)4.1布點原則4.1.1科學性原則采樣點位應(yīng)具有典型性和代表性，能充分滿足調(diào)查評估工作的目標要求，能真實反映水域生態(tài)系統(tǒng)中周叢生物真實分布情況。4.1.2系統(tǒng)性原則布設(shè)點位宜涵蓋調(diào)查區(qū)域范圍內(nèi)周叢生物可能分布的類型，采樣點數(shù)量宜滿足統(tǒng)計學要求。4.1.3重點性原則宜把調(diào)查區(qū)域內(nèi)水域生態(tài)系統(tǒng)及稻田作為調(diào)查重點區(qū)域。周叢生物生物量、性質(zhì)、水動力和生境差異較大時，宜提高點位布設(shè)密度。4.1.4持續(xù)性原則布設(shè)點位確定后宜長期保持固定。4.2布點前期準備4.2.1背景調(diào)查3背景信息，采樣點位信息表詳見附錄A。4.2.2人員組織組織具有相關(guān)專業(yè)背景的人員，明確任務(wù)分工，對人員做好觀測方法和野外操作規(guī)范的工作培訓(xùn)。加強野外調(diào)查安全培訓(xùn)工作，提高相關(guān)人員安全意識。4.3布點要求4.3.1農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)布點4.3.1.1稻田布點對于同一調(diào)查區(qū)域的稻田點位布設(shè)，應(yīng)包含集約農(nóng)業(yè)區(qū)、傳統(tǒng)自耕區(qū)、重要水體上下游及附近的稻田，每類稻田至少布設(shè)3個采樣點。若調(diào)查區(qū)域的稻田不存在差異化分布，布設(shè)點位的稻田應(yīng)涵蓋調(diào)查區(qū)域的流域范圍，東南西北主要方位均有設(shè)點。盡量選擇具有一定規(guī)模的連片稻田，避免將點位布設(shè)在222（1000畝）以上的設(shè)6~10個點位。稻田點位避免距離田壟較近的受人為擾動頻繁的區(qū)域，盡量靠近稻田中心位置等相對穩(wěn)定的地段。對于多個點位同時布設(shè)在同一稻田的情況，主要依據(jù)均勻隨機布點的原則，根據(jù)周叢生物生長情況等進行實地調(diào)整，點位相互間距離應(yīng)大于5m。4.3.1.2溝渠布點溝渠點位應(yīng)與稻田點位相對應(yīng)，在每條溝渠中段布設(shè)1~2個點位，或布設(shè)不超過對應(yīng)稻田樣點數(shù)的點位。4.3.2淺水生態(tài)系統(tǒng)布點4.3.2.1河流布點在河流上、中、下游，干、支流，以及干支流匯合點處均應(yīng)設(shè)置點位。同一干/支流上任意兩個相鄰點位間的地理距離應(yīng)大于5km，若河流較短，則采樣點位應(yīng)至少設(shè)置3個，覆蓋河流的上、中、下游，宜包括4.3.2.2池塘布點2~22（30畝）設(shè)3~6個點位。點位可圍繞池塘均勻布設(shè)，但應(yīng)覆蓋進水區(qū)、出水區(qū)和池塘灣區(qū)。4.3.2.3水庫布點將點位布設(shè)在水庫的水陸交錯帶附近，水域面積小于10km2設(shè)3~5個點位，10km2~50km2設(shè)4~6個點位，大于50km2設(shè)5~8個點位，超過100km2設(shè)10~20個點位。點位可圍繞水庫均勻布設(shè)，但應(yīng)覆蓋進水區(qū)、出水區(qū)和水庫中段。4.3.2.4湖泊布點根據(jù)湖泊水體形態(tài)特點、水文狀況和周叢生物的分布特征以及水體受干擾狀況等因素，將湖泊區(qū)域劃分成相對均質(zhì)的敞水區(qū)、湖濱帶，污染區(qū)或相對清潔區(qū)等，每個小區(qū)內(nèi)設(shè)置1~3個有代表性的點位，主4要分布在湖濱帶。對于均質(zhì)化程度較高的湖泊，可按照水庫布點方法均勻設(shè)置點位。4.3.2.5濕地布點對于非均一地面的濕地，每類設(shè)置1~3個點位。對于均一地面的濕地，點位布設(shè)應(yīng)在區(qū)域內(nèi)進行簡單隨機抽樣代替整體分布，面積小于1km2設(shè)3~5個點位，面積1km2~10km2設(shè)5~8個點位，面積大于2可按照水庫布點方法均勻設(shè)置點位。5樣品采集與保存5.1材料和器具5.1.1主要材料蒸餾水或同等純度的水、冰袋和液氮等。5.1.2主要器具金屬刮刀、鑷子、短尺、樣品袋或樣品瓶、聚乙烯樣品袋或螺紋蓋玻璃瓶、一次性無菌手套、GPS定位儀、溫度計和便攜pH計等。5.2樣品采集5.2.1采樣計劃制定要點5.2.1.1確定采樣基質(zhì)根據(jù)生境類型或溝渠、河流底質(zhì)，確定周叢生物附著的基質(zhì)。池塘、水庫、湖泊以近水岸的無機基質(zhì)（如石頭等）和有機基質(zhì)（如水生植物等）作為周叢生物附著基質(zhì)，稻田以表層土壤作為周叢生物附著基質(zhì)。不同基質(zhì)上的樣品分開收集保存。5.2.1.2確定樣品數(shù)每份樣品保證取至少3個平行樣品。5.2.2采樣時間和采樣頻率5.2.2.1農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)采樣時間和頻率水稻移栽后每月采集樣品一次，移栽后第一個月可半月采集一次。農(nóng)田溝渠周叢生物采樣時間和頻率與稻田采樣相對應(yīng)。5.2.2.2淺水生態(tài)系統(tǒng)采樣時間和頻率河流、池塘、湖泊、水庫、濕地等生境的周叢生物宜按季節(jié)或豐、平、枯水期開展采樣。采樣時間間隔宜相同，選擇一天中的同一時段。5.2.3樣品采集方法5.2.3.1確定采樣容積每個樣點采集的周叢生物容積應(yīng)保持一致?；旌喜蓸討?yīng)根據(jù)混合點數(shù)量確定每點采集量。55.2.3.2采樣順序需采集周叢生物上覆水或下層土壤樣品時，應(yīng)先采集水樣后再采集周叢生物和土壤樣品。5.2.3.3樣品刮取使用鑷子或刮刀等工具從水下浸沒的介質(zhì)，包括稻田土壤、水生植物、石塊表面剝離周叢生物，并移至聚乙烯采樣袋內(nèi)。5.2.3.4原位厚度檢測利用原位采樣器對周叢生物進行原位厚度檢測和固定，原位采樣器可參考附錄B。5.2.3.5器具清洗應(yīng)及時清洗所有接觸過樣品的采樣器具，使用前使用0.1mol/L鹽酸溶液消毒。5.2.4樣品標識和記錄5.2.4.1樣品標識在樣品袋或樣品瓶外側(cè)標注樣品編號、采樣日期、水體名稱、采樣點位、采樣人姓名。5.2.4.2樣品記錄采樣現(xiàn)場應(yīng)記錄樣品經(jīng)緯度、生境情況等信息，記錄表格可參考附錄C。5.3樣品的處理與儲存5.3.1樣品儲存容器5.3.1.1常規(guī)樣品保存周叢生物一般常用聚乙烯袋存儲。5.3.1.2特殊樣品保存有機物污染的周叢生物宜采用帶有螺紋蓋的玻璃瓶。5.3.2樣品運輸和儲存5.3.2.1從田間采樣到進行分析之前宜儲存在0℃~4℃的保溫箱中。5.3.2.2運輸中應(yīng)仔細存放樣品，以確保樣品無破損、樣品之間無污染。避免強光照射及強烈震動。5.3.2.3周叢生物樣品運至實驗室后，分析物理指標的樣品應(yīng)風干或儲存于4℃,分析化學指標的樣品應(yīng)進行液氮處理并儲存于-20℃,分析生物指標的樣品應(yīng)進行液氮處理并儲存于-80℃。6物理指標分析測試6.1覆蓋度測定6.1.1被測點選定在擬開展調(diào)查的生境內(nèi)，隨機選定觀測點，點與點之間間距為15m~30m。觀測點數(shù)參照第4章6執(zhí)行。6.1.2針刺法測定覆蓋度覆蓋度應(yīng)在采樣現(xiàn)場測定。將1m2的被測點方框以間隔網(wǎng)格線方式劃分為10cm×10cm，15cm×15cm，20cm×20cm三種不同格網(wǎng)密度，并重復(fù)該過程5次~10次，取均值作為該被測點的最終結(jié)果。6.1.3覆蓋度計算測量每個隨機被測點的覆蓋面積，求取平均值，然后乘以總的稻田面積得到所測稻田的周叢生物面積。覆蓋度為周叢生物面積占稻田總面積之比，一般用百分數(shù)表示。覆蓋度（PBC）計算見公式（1PBC=×100…………（1）式中：Totalarea——所研究稻田區(qū)域的總面積，單位為平方米（m2）。6.2厚度測定6.2.1材料與設(shè)備6.2.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、二甲基亞砜溶液、綠色熒光核酸染料、0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）和抗熒光淬滅封片劑等。6.2.1.3主要設(shè)備：激光掃描共聚焦顯微鏡等。6.2.2測定步驟6.2.2.1樣品制備6.2.2.1.1用鑷子取小塊新鮮的周叢生物于潔凈載玻片，并放置于潔凈的培養(yǎng)皿中，用0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）輕柔洗去表面殘余培養(yǎng)液和雜質(zhì)。6.2.2.1.2染料的配制：取潔凈離心管，用錫箔紙包緊，向其中加1mL二甲基亞砜溶液，取1.5μL綠色熒光核酸染料加入二甲基亞砜溶液中，振蕩混勻，待用。6.2.2.1.3加200μL染料于載玻片上，確保整個片子被染料液覆蓋，用錫箔紙包起放有載玻片的培養(yǎng)皿，染色20min~30min后，取出載玻片，并將其邊緣液體吸干，加10μL抗熒光淬滅封片劑到潔凈的蓋玻片上，將蓋玻片放置于周叢生物上壓緊，并排除氣泡，確保視野清晰不流動。將制備好的片子用錫箔紙包好，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。6.2.2.2激光掃描共聚焦顯微鏡成像激光共聚焦掃描顯微鏡對染色周叢生物進行顯微觀察和圖像采集，用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描限制在周叢生物樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，可以獲得周叢生物不同深度層次的圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法應(yīng)按照JY/T0586要求分析。6.2.2.3最大厚度測定對周叢生物樣本由內(nèi)（周叢生物與玻片相貼面）向外（周叢生物游離面）沿三維坐標系Z軸逐層水平掃描，步距14μm，當出現(xiàn)2個連續(xù)的水平層面，Z軸距離較小的水平層面上能夠觀察到周叢生物結(jié)構(gòu)，Z軸距離較大的水平層面上不能夠觀察到周叢生物結(jié)構(gòu)，則后一水平層面的Z軸距離為周叢生物最大厚76.3二維形態(tài)表征6.3.1材料與設(shè)備1%鋨酸固定液等。6.3.1.3主要設(shè)備：冷凍干燥機和掃描電子顯微鏡等。6.3.2測定步驟6.3.2.1樣品制備6.3.2.1.1取適量周叢生物展片于蓋玻片或濾膜上，用2.5%戊二醛溶液固定2h，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）漂洗三次，每次10min，再用1%鋨酸固定液固定1h~2h，固定結(jié)束再重復(fù)磷酸鹽緩沖液漂洗過程。6.3.2.1.2將固定好的周叢生物樣品冷凍干燥處理，以接近于物質(zhì)的自然狀態(tài)直接放到掃描電鏡中進行觀察。6.3.2.1.3若觀察割裂面結(jié)構(gòu)，應(yīng)根據(jù)需求從不同角度切割周叢生物樣品。6.3.2.1.4若試樣導(dǎo)電性弱時，一般選擇鍍膜處理。通常情況選擇鍍金（Au）膜，如果對分辨率有較高的如果要對樣品進行嚴格的化學定量分析，則不能鍍金屬膜，因為金屬膜對X射線有較強的吸收，對定量有較大影響，可選用蒸鍍碳膜。6.3.2.2掃描電子顯微鏡成像應(yīng)按照GB/T33834要求進行掃描電子顯微鏡成像。6.4三維結(jié)構(gòu)表征6.4.1材料與設(shè)備6.4.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）等。6.4.1.2主要材料：載玻片、濾膜和吸水紙等。6.4.1.3主要設(shè)備：激光掃描共聚焦顯微鏡。6.4.2測定步驟6.4.2.1樣品制備取小片新鮮周叢生物或直接剪切至所需大小置于潔凈載玻片上，用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.4.2.2三維結(jié)構(gòu)成像激光掃描共聚焦顯微鏡觀察周叢生物樣品并采集不同層面圖像，構(gòu)建三維圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法參照JY/T0586。8DB32/T4677—20246.4.3注意事項6.4.3.1掃描過程耗時較長，而且只能掃描不動的微生物，許多活動的大型微生物，例如周叢生物中原生動物等，因運動比較劇烈而會對成像造成一定的影響。6.4.3.2某些環(huán)境雜質(zhì)可能會對某些活體細胞的活性造成一定的負面影響。在樣品制備中盡可能清洗干凈，同時適當?shù)卣{(diào)整激光的光強，用最弱的光對樣品進行照射掃描。7化學指標分析測試7.1總有機碳、總無機碳和總碳含量7.1.1測定方法7.1.1.1應(yīng)按照DZ/T0279.27要求測定總有機碳含量。7.1.1.2應(yīng)按照LY/T1250中的氣量法要求測定總無機碳含量。7.1.1.3總碳的含量為總有機碳和總無機碳的含量之和。7.1.2樣品預(yù)處理7.1.2.1總有機碳：新鮮周叢生物樣品采集后，用去離子水洗凈，再用普通濾紙濾干水后，60℃條件下，烘干8h，得到周叢生物干樣。再將周叢生物干樣經(jīng)研磨后，經(jīng)過60目（0.25mm）篩孔篩分后，精確稱取0.5g（精準到0.1mg用長條硫酸紙將樣品置于干燥的硬質(zhì)玻璃試管內(nèi)，并加入0.1g粉末狀硫酸銀。用移液管加入5mL重鉻酸鉀標準溶液，然后用移液管注入5.0mL濃硫酸，搖勻，待測。7.1.2.2總無機碳：稱取通過60目（0.25mm）篩孔的周叢生物干樣0.5g~10g于250mL錐形瓶中。用蒸餾水潤濕樣品、瓶口和瓶壁，并向彎曲小試管中注入約10mL3mol/L的鹽酸溶液，再將其放入錐形瓶7.1.3注意事項7.1.3.1總有機碳7.1.3.1.1測定周叢生物有機質(zhì)應(yīng)采用風干樣品，若未風干樣品含有較多的Fe2+、Mn2+及其他還原性物質(zhì)消耗重鉻酸鉀，可使結(jié)果偏高。試驗前將樣品磨細鋪開，在室內(nèi)通風處風干約10d。7.1.3.1.2本方法不適用于含氯較高的樣品，若樣品含有少量的氯則可以加少量Ag2SO4（約0.1g使氯離子沉淀以去除其測試干擾。7.1.3.1.3加熱時產(chǎn)生的二氧化碳氣泡不是真正的沸騰，待溶液表面沸騰開始計時煮沸5min。7.1.3.1.4轉(zhuǎn)移試管溶液時，應(yīng)用少量蒸餾水進行沖洗，勿損失溶液。7.1.3.1.5滴定亞硫酸鐵消耗量若小于空白試驗的1/3時，有未完全氧化的可能，應(yīng)舍去重做。7.1.3.2總無機碳7.1.3.2.1周叢生物中的碳酸鹽主要以碳酸鈣為主，但也有的碳酸鹽以碳酸鈣-碳酸鎂和碳酸氫鹽等存在，不過都表示為CaCO3或者CaCO3?CO2（g·kg-1）。7.1.3.2.2為防止誤差較大，試驗前應(yīng)檢測氣密性。7.1.3.2.3可用蒸餾水濕潤樣品和錐形瓶瓶壁，以緩解碳酸鹽和鹽酸反應(yīng)產(chǎn)熱的影響，也有助于瓶內(nèi)的水氣壓平衡。7.1.3.2.4操作過程中避免用手直接觸碰反應(yīng)器，防止因手的熱量使氣體膨脹，產(chǎn)生誤差。9DB32/T4677—20247.1.3.2.5測量過程中要隨時調(diào)整量氣管的液面與水準器的液面相平，勿相差太大。7.2總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量7.2.1測定方法7.2.1.1按照NY/T2017中的凱氏消煮法要求測定總氮含量。7.2.1.2按照HJ634中的氯化鉀溶液提取?分光光度法要求測定氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。7.2.2樣品預(yù)處理7.2.2.1樣品采集無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運輸保存，并在3d內(nèi)完成分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱中保存。新鮮樣品清洗后，用吸水紙吸干表面水分，留存?zhèn)錅y。7.2.2.2樣品消解稱取周叢生物干樣品0.100g~0.500g（精確到0.001g）于100mL消煮管中，加入3mL濃硫酸，再加入1.1g催化劑，加蓋回流漏斗，置于消煮爐加熱，待沒有泡沫時，適當提高溫度，微微煮沸，使得固體完全消失成為溶液，最終消煮液澄清透亮，呈現(xiàn)灰白色。消煮液冷卻后待用。7.2.2.3樣品破碎稱取新鮮周叢生物干樣品0.100g~0.500g（精確到0.001g）于100mL消化管，加入3mL氯化鉀溶液，然后在冰浴中進行超聲破碎處理，超聲強度200W，超聲時間3s，間隔10s，重復(fù)30次。破碎后，將其轉(zhuǎn)入50mL聚乙烯離心管中，在3000r/min條件下，離心10min，將上清液保存至比色管中，待測。7.2.3注意事項7.2.3.1在重復(fù)性條件下獲得的三次獨立測試結(jié)果的絕對誤差不應(yīng)超過算術(shù)平均值的7%。7.2.3.2每批樣品應(yīng)測定10%的加標樣品。氨氮加標回收率應(yīng)在80%~120%之間；亞硝酸鹽氮加標回收率應(yīng)在70%~120%之間；硝酸鹽氮加標回收率應(yīng)在80%~120%之間。7.2.3.3還原柱中的鎘粉在使用前需要檢驗其還原性。7.3磷含量7.3.1測定方法應(yīng)按照NY/T88中的氫氧化鈉熔融—鉬銻抗比色法要求測定總磷含量。7.3.2樣品預(yù)處理精準稱取0.2500g通過60目（0.25mm）篩的烘干（一般為60℃左右）的周叢生物干樣，輕輕放置于鎳或銀坩堝底部，避免將樣品沾在坩堝壁上，加入幾滴無水乙醇稍微濕潤樣品，加2.0g（為樣品的8倍）固體氫氧化鈉在樣品表面鋪平整，放置在干燥器中，以防吸濕潮解。將坩堝放入高溫電爐中，由室溫升到300℃,保溫30min，再升溫至750℃,保溫15min，后冷卻坩堝，在坩堝中加10mL蒸餾水，放在電爐上加熱至80℃左右，熔塊溶解后再煮沸5min，然后將坩堝內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用熱蒸餾水及2mL硫酸多次洗滌坩堝并倒入容量瓶內(nèi)，盡量不要使總體積超過40mL。然后往容量瓶中加5滴1∶1鹽酸溶液及5mL硫酸溶液，輕輕振蕩，靜置冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50mL，搖勻后靜置至澄清或用無磷濾紙過濾，濾液貯于50mL三角瓶中，待測。同時做至少兩個空白試驗。7.3.3注意事項7.3.3.1在用氫氧化鈉熔融樣品時，為防止濺跳現(xiàn)象，一般從低溫開始，逐漸脫水后，再高溫加熱。7.3.3.2若使用銀坩堝進行試驗，需注意控制溫度，銀坩堝在960℃時會融化。7.3.3.3熔融完全的熔塊冷卻后會凝結(jié)，并呈現(xiàn)出淡藍色或藍綠色，如熔塊呈棕黑色則表示還沒有熔融完全，應(yīng)再按熔融的步驟再熔一次。7.3.3.4鉬銻抗法要求顯色液中硫酸濃度為c（1/2H2SO4）=0.55mol·L-1。如果酸度小于c（1/2H2SO4)=0.45mol·L-1，顯色時間縮短，但穩(wěn)定時間變得較短；如果酸度大于c（1/2H2SO4)=0.65mol·L-1，顯色時間延長。如果不確定待測液中的原有酸度，要先中和處置。7.4鉀含量應(yīng)按照NY/T2017中的電感耦合等離子體質(zhì)譜法要求測定鉀含量。7.4.2樣品預(yù)處理用無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運輸保存，并在3d內(nèi)完成測試分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱保存。將待測的周叢生物樣品干燥后研7.4.3注意事項7.4.3.1本方法的檢出限為70μg·kg-1。7.4.3.2在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的15%。7.5鈉含量7.5.1測定方法按照LY/T1246中的火焰原子吸收光譜法要求測定鈉含量。7.5.2樣品預(yù)處理首先，將鋁盒60℃下烘干至恒重，稱重。然后準確稱取2g~3g新鮮周叢生物，用普通濾紙濾干后，置于坩堝中，100℃下烘干（8h）。冷卻至室溫，稱重，計算周叢生物含水率。取適量干周叢生物樣品碾碎7.5.3注意事項7.5.3.1儀器校準：在進行火焰光度測定前，需要對光度計進行校準，以確保測定結(jié)果的準確性。通常，會使用標準溶液進行校準。7.5.3.2激發(fā)條件：火焰溫度要適當，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴重，影響測量的線性關(guān)系。7.6.1測定方法按照GB/T35871要求測定鈣、鎂含量。7.6.2樣品預(yù)處理準確稱取通過60目（0.25mm）孔徑篩的周叢生物干樣0.2g，加入10mL濃硫酸，并在通風櫥中加熱消煮，等瓶內(nèi)硫酸開始冒白煙后，繼續(xù)加熱5min，然后靜置冷卻。等管內(nèi)溫度冷卻至70℃左右，再逐滴滴加10滴過氧化氫溶液，滴加時應(yīng)緩慢滴加，避免容器氣壓過高。利用強酸的氧化性與酸性，使周叢生物中的有機物質(zhì)完全分解、氧化，呈氣態(tài)逸出，分析物質(zhì)及共存離子轉(zhuǎn)化為無機物狀態(tài)，以穩(wěn)定的化學形式存在于澄清溶液中。7.6.3注意事項7.6.3.1單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產(chǎn)生危險，因此在日常工作中多將兩種或兩種以上的強酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機物質(zhì)能快速而又平穩(wěn)地消解。7.6.3.2元素含量小于0.1μg·g-1時，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的20%。7.6.3.3元素含量在0.1μg·g-1~1μg·g-1時，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的15%。7.6.3.4元素含量大于lμg·g-1時，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。7.7硫含量7.7.1測定方法按照LY/T1270要求測定硫含量。7.7.2樣品預(yù)處理用無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運輸保存，并在3d內(nèi)完成分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱保存。將待測的周叢生物樣品干燥后研磨，稱取約0.2g~0.5g（精確到0.0001g加入150mL高型錐形瓶中待測。7.7.3注意事項在重復(fù)性條件下，任意兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值需小于或等于算術(shù)平均值的10%。7.8鐵含量7.8.1測定方法應(yīng)按照HJ/T345的要求測定總鐵和亞鐵（二價鐵離子）含量。三價鐵離子的濃度為總鐵的濃度減去二價鐵離子的濃度。7.8.2樣品預(yù)處理7.8.2.1亞鐵（二價鐵離子準確稱取5.0g干重的周叢生物（提前測定含水量）于錐形瓶中，加入浸提劑DB32/T4677—2024100mL，搖勻振蕩（5min，120r/min離心（5min，8000r/min）獲得上清液。7.8.2.2總鐵：稱取干重為5g的新鮮周叢生物樣品，60℃烘干8h，將烘干的周叢生物樣品在瓷研缽中碾磨過60目（0.25mm）篩，稱取適量過篩后周叢生物樣品置于石英坩堝中，在電爐上加熱使其碳化，再移入高溫電爐，在500℃下繼續(xù)加熱2h~3h，灰化完成，待其冷卻后，加入5mL稀硝酸溶液（1∶1）溶解灰分，將溶液全部轉(zhuǎn)移入50mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線，最后再用0.45μm濾紙過濾，得到澄清濾液，進行下一步總鐵含量的測定。7.8.3注意事項新鮮周叢生物從培養(yǎng)基取出后，應(yīng)盡快測量，沒有用完的樣品勿放回培養(yǎng)基，以免造成污染。7.9錳含量7.9.1測定方法應(yīng)按照GB/T35871要求測定錳含量。7.9.2樣品預(yù)處理準確稱取5g的周叢生物干樣，置于150mL錐形瓶中，加入30mLHNO3?HClO4酸混合溶液（HNO3與HClO4的體積比為5∶1不要晃動錐形瓶，可在錐形瓶上方放一個漏斗，在漏斗中放一顆稍大于漏斗口徑的玻璃珠，以減少靜置過程中溶液的揮發(fā)以及消煮過程中溶液的蒸發(fā)，將加完酸的溶液靜置于通風櫥中過夜。在通風櫥中，把靜置一夜后的錐形瓶置于調(diào)溫板或調(diào)溫爐上加熱消煮5h左右（溫度應(yīng)控制在能讓消煮液微沸消煮過程中會產(chǎn)生棕色二氧化氮氣體（戴帶上護具，注意防護當不再產(chǎn)生棕色氣體時，逐漸升溫，將溶液加熱至幾乎被蒸干。冷卻過后，將溶液及不溶性顆粒物全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用蒸餾水定容后，再用0.45μm濾紙過濾，得到澄清濾液，待測。7.9.3注意事項單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產(chǎn)生危險，因此，在日常工作中多將兩種或兩種以上的強酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機物質(zhì)能快速而又平穩(wěn)地消解。7.10銅含量7.10.1測定方法應(yīng)按照GB/T35871要求測定銅含量。7.10.2樣品預(yù)處理在錐形瓶中加入周叢生物干樣0.500g~1.000g（精確到0.0001g然后加入30mL提前制備的混合酸，蓋上表面皿，以減少沸騰過程中的蒸發(fā)。調(diào)節(jié)電熱板溫度以保持錐形瓶中的液體沸騰，錐形瓶中會出現(xiàn)大量NO2棕色氣體。當不再釋放NO2氣體時升高溫度，至消化液澄清透明（無色或微黃色）。如果消化液變成深棕色，滴入少量硝酸，此時消化液釋放白色煙，消化液的顏色進一步轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色透明，抑或是轉(zhuǎn)變成微黃色時，將消化液靜置至冷卻，待測。7.10.3注意事項7.10.3.1單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產(chǎn)生危險，因此，在日常工作中多將兩種或兩種以上的強酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機物質(zhì)能快速而又平穩(wěn)地消解。7.10.3.2在重復(fù)性條件下對周叢生物中的銅含量進行兩次獨立的測定，計算兩次測定的周叢生物中的銅含量的絕對差值和算術(shù)平均值，絕對差值不能超過算術(shù)平均值的20%。7.10.3.3此方法中所使用的試劑的純度均為優(yōu)級純（GR）。7.10.3.4此方法中所用的水為去離子水或重蒸餾水。7.11鋅含量7.11.1測定方法按照LY/T1270要求測定鋅含量。7.11.2樣品預(yù)處理8mL濃硫酸，振蕩或放置過夜（優(yōu)選）后，滴加10滴高氯酸，搖勻，瓶口放一小漏斗，置于電爐上加熱消煮至瓶內(nèi)液體開始轉(zhuǎn)白后，繼續(xù)消煮20min，全部消煮時間為45min~60min，將冷卻后的消煮液用去離子水洗入100mL容量瓶中，沖洗時用水應(yīng)少量多次，輕輕搖動容量瓶，蒸餾水定容，用干燥漏斗和濾紙濾入干燥的100mL三角瓶中。7.12鉬含量應(yīng)按照GB/T35871要求測定鉬含量。7.12.2樣品預(yù)處理7.12.3注意事項7.1.2.3.1鉬含量小于0.1mg/kg時，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的20%。7.12.3.2鉬含量在0.1mg/kg~1mg/kg時，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的15%。7.12.3.3鉬含量大于1mg/kg時，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。7.13硅含量7.13.1測定方法應(yīng)按照LY/T1270要求測定硅含量。7.13.2樣品預(yù)處理7.13.3注意事項7.13.3.1如周叢生物樣品含鐵較多，可先用100g·L-1鹽酸洗滌沉淀，以免濾液體積過大。穿孔。7.13.3.3檢查Fe3+表示已洗凈：在白瓷比色板凹槽中，接一滴濾液，加一滴100g·L-1硫氰化鉀，溶液呈紅色表示有Fe3+存在，無色表示已洗凈。7.13.3.4高氯酸應(yīng)稀釋到60%后再使用，過濃易引起爆炸。7.13.3.5消化時高氯酸已分解完畢，但殘留物仍呈黑色或棕色時，說明由于硝酸不足或溫度過高，硝酸分解過快，氧化不完全。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)立即將樣品取下，冷卻后再加3mL~4mL硝酸和1mL高氯酸，繼續(xù)消化直到消化液完全呈白色為止。若小漏斗上有黑色物質(zhì)，應(yīng)使用少量濃硝酸沖洗，再重新消化。7.13.3.6因為鉀可沉淀為高氯酸鉀，故應(yīng)把過多的高氯酸排除，不至在消化液中形成高氯酸鉀沉淀，因此，消化終了時，要求出現(xiàn)硫酸回流即可。7.13.3.7為避免已脫水的二氧化硅再次水化溶解，當以鹽酸作溶劑時，同時要考慮鹽酸的濃度，以阻止二氧化硅再度水化為宜。7.14.1測定方法應(yīng)按照NY/T1378要求測定氯含量。7.14.2樣品預(yù)處理確加入50mL純水，用橡皮塞塞緊后超聲30min。7.14.3注意事項7.14.3.1所有玻璃器皿均需在使用前用5%的硝酸浸泡4h，然后用去離子水浸泡并反復(fù)沖洗3次~7.14.3.2在重復(fù)性條件下獲得兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值，氯離子含量小于100mg·kg-1時，不應(yīng)超過算術(shù)平均值的5%，氯離子含量大于或等于100mg·kg-1時，不應(yīng)超過算術(shù)平均值的3%。7.15硼含量7.15.1測定方法應(yīng)按照NY/T149要求測定硼含量。7.15.2樣品預(yù)處理準確稱取0.5g過篩周叢生物干品（精確到0.0001g加1mL~2mL飽和氫氧化鈣溶液混勻，低溫蒸干，并加熱炭化至無煙。隨即將其移入馬弗爐中，升溫至400℃并保持30min，然后升溫至500℃并保持1.5h進行灰化。冷卻取出后加入10mL硫酸溶液溶解灰分，靜置1h。將溶解液全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并定容至標度。用干濾紙過濾，濾液儲存于聚乙烯試劑瓶中供測硼用。7.15.3注意事項兩次測試結(jié)果的相對標準偏差不超過10%。DB32/T4677—20248生物指標分析測試8.1微生物組成和多樣性8.1.1通則8.1.1.116SrDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10個保守區(qū)域和9個高變區(qū)域，宜用于測定周叢生物中原核微生物的組成與物種多樣性。8.1.1.218SrDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，宜用于定量周叢生物中真核微生物的組成與物種多樣性。8.1.1.3ITS分為兩個區(qū)域ITS1h和ITS2，ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之間，ITS2位于真核生物rDNA序列5.8S和28S之間。對ITS1或ITS2進行測序，用于測定周叢生物微生物中真菌群落組成與多樣性。8.1.2測定步驟8.1.2.1DNA提取應(yīng)按照GB/T30988提取周叢生物DNA。8.1.2.2引物選擇8.1.2.2.116SrDNA引物為：515F（5'?GTGCCAGCMGCCGCGGTAA?3'）/907R（5'?CCGTCAATTCMTTTRAGTTT?3'）8.1.2.2.318SrDNA引物為：528F（5'?GCGGTAATTCCAGCTCCAA?3')/706R（5'?AATCCRAGAATTTCACCTCT?3'）8.1.3其他其他測序步驟應(yīng)按照GB/T30989要求。8.2磷脂脂肪酸群落結(jié)構(gòu)8.2.1儀器與試劑8.2.1.1主要儀器：振蕩器、離心機、氮吹儀、水浴鍋和氣相色譜儀。8.2.1.2主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、磷酸鹽緩沖液、三氯甲烷、甲醇、丙酮、甲苯、氫氧化鉀、正己烷和乙酸等。8.2.1.3主要材料：錐形瓶、離心管和硅膠（6mL，500mg）層析柱等。8.2.2操作步驟稱取10mg新鮮的去雜質(zhì)的周叢生物于錐形瓶中，依次加磷酸鹽緩沖液7.2mL、三氯甲烷8mL、甲30min，靜置過夜；離心3min（2500r/min)分離水相、三氯甲烷相及固體相三相，移出三氯甲烷相，并用N2將其吹干；三氯甲烷相過硅膠（6mL，500mg）層析柱，依次用三氯甲烷、丙酮、甲醇洗滌層析柱，收集甲醇洗滌液，用N2吹干；用1mL體積比為1∶1的甲醇和甲苯的混合溶液與1mL0.2mol/L的氫氧化鉀溶液溶解樣品，并在30℃~35℃的水浴中保溫15min，冷卻至室溫，再加入2mL體積比為4∶1的正己烷、三氯甲烷混合溶液，用乙酸將溶液調(diào)至中性，加2mL蒸餾水，振搖5min，去水相，取底部正己烷相進行氣相色譜測試，再利用計算機對PLFA圖譜分析測定其成分及含量。8.2.3數(shù)據(jù)分析8.2.3.1PLFA的結(jié)構(gòu)分析脂肪酸可分為直鏈飽和脂肪酸（SSFA）、支鏈飽和脂肪酸（BSFA）、單鍵不飽和脂肪酸（MUFA）、環(huán)丙烷脂肪酸（CFA）、羥基脂肪酸（OHFA）和多鍵不飽和脂肪酸（PUFA按照所得脂肪酸的結(jié)構(gòu)分成上述6種，并統(tǒng)計其相對含量及絕對含量。8.2.3.2分布特性分析將所獲得的數(shù)據(jù)先進行單因子方差分析，后構(gòu)建矩陣，并將數(shù)據(jù)進行中心化，以歐式距離為聚類尺度，用組間連接法進行系統(tǒng)聚類。8.2.3.3PLFA多樣性分析8.2.3.4多樣性指數(shù)H=-∑（PilnPi） 其中：Pi=Ni/N Pi——第i種特征磷脂脂肪酸占該試驗中總特征磷脂脂肪酸個數(shù)的比例；Ni——第i種磷脂脂肪酸含量；N——該試驗中總特征磷脂脂肪酸個數(shù)。8.2.3.5均勻度J=H/lnS……（4）式中：S——微生物中PLFA生物標記出現(xiàn)的頻次，即豐富度。8.2.3.6優(yōu)勢度D=1-∑Pi2式中：Pi——第i種特征磷脂脂肪酸占該試驗中總特征磷脂脂肪酸個數(shù)的比例。8.2.3.7主成分分析周叢生物PLFA主成分分析：對檢測出的PLFA樣本，先構(gòu)建相關(guān)系數(shù)矩陣，后基于特征值抽取主成分，輸出碎石圖與載荷圖。DB32/T4677—20248.3胞外聚合物8.3.1儀器與實際試劑8.3.1.1主要儀器：振蕩器、離心機、超聲破碎儀和冷凍干燥機。8.3.1.2主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、氫氧化鈉溶液、無水乙醇、氯化鈉溶液等。8.3.1.3主要材料：纖維濾膜、陽離子交換樹脂、離心管和纖維素（RC/MW）透析袋（3500Da）等。8.3.2技術(shù)方法8.3.2.1總胞外聚合物提取方法1稱取1g新鮮周叢生物，記錄周叢生物濕重，并根據(jù)含水率將其轉(zhuǎn)化為干重。加入2mL2mol/L的120r/min離心20min（4℃,10000r/min后將上清液用0.45μm纖維濾膜過濾，取濾液。向2mL含有EPS的提取液中加入4倍體積的無水乙醇，在4℃下放置12h，再次離心10min（10000r/min棄去上清液，所得沉淀物質(zhì)為粗胞外聚合物。8.3.2.2總胞外聚合物提取方法2取適量周叢生物離心（10000r/min，10min，4℃)回收上清液1，殘渣回收并重新懸浮在蒸餾水中，在40W、20kHz功率下超聲處理2min，離心回收上清液2。上清液1和2混合后加入陽離子交換樹脂，上清液與陽離子交換樹脂的體積質(zhì)量比為1mL：0.6g，混合后放置在200r/min，4℃的振蕩器中振蕩2h。振蕩過后離心（4000r/min，30min，4℃)樹脂與周叢生物混合物，取含有胞外聚合物的上清液，后將上清液用0.45μm纖維濾膜過濾，將濾液放于-80℃冷凍保存，經(jīng)-60℃冷凍干燥機中冷凍干燥至恒重。8.3.2.3溶解性胞外聚合物（S?EPS）、緊縛型胞外聚合物（T?EPS）、松散型胞外聚合物（L?EPS）提取將周叢生物取出置于50mL離心管中，并與蒸餾水混合形成50mL懸浮液。4℃、6000r/min持續(xù)10min，收集上清液作為S?EPS部分，同時將沉淀物重新懸浮在0.05%（質(zhì)量分數(shù)）氯化鈉溶液中，并在20kHz下超聲2min，后懸浮液在8000r/min下離心10min，收集上清液用于測量L?EPS，用0.05%（質(zhì)量分數(shù)）的氯化鈉溶液再次重懸殘余沉積物，并在20kHz下超聲20min，70℃加熱30min后，懸浮液在12000r/min離心20min，收集上清液作為T?EPS部分。以上全