第九章疾病與人類健康

第九章疾病與人類健康腫瘤與癌癥人免疫缺陷病毒——HIV乙型肝炎病毒——HBV人禽流感的分子生物學(xué)機(jī)制嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥——SARS的分子機(jī)制基因治療Contents第一節(jié)腫瘤與癌癥內(nèi)容提要：反轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因原癌基因（細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因）產(chǎn)物及其分類原癌基因的表達(dá)調(diào)控基因相互作用與癌基因表達(dá)

癌：是一群不受生長調(diào)控而繁殖的細(xì)胞，也稱惡性腫瘤。良性腫瘤：是一群僅局限在自已的正常位置，且不侵染周圍其他組織和器官的細(xì)胞。細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)：基因突變一、癌基因（oncogene)癌基因的分類病毒癌基因：(virusoncogene,v-onc)DNA病毒(乙肝病毒)、RNA病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒）細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因：(cellular-oncogene,c-onc)原癌基因的突變產(chǎn)物。(一)反轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因（P339）Rous于1910年首先發(fā)現(xiàn)雞肉瘤病毒（后稱勞斯肉瘤病毒RSV），研究證明它是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，接種給雞后可誘發(fā)肉瘤。1966年，85歲的勞斯獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1、反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒結(jié)構(gòu)（P339）

調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄

LTR

gag

pol

env

src

LTR

長末端重復(fù)序列癌基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒表面糖蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶

產(chǎn)生病毒垮膜蛋白2、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生p60src蛋白質(zhì)，磷酸化蛋白。靶蛋白磷酸化（P341）3、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制斷裂基因完整的沒有斷裂的可讀框

(二)細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因

細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因?qū)嵸|(zhì)上就是由一類原癌基因突變而來。當(dāng)原癌基因在某些外界因素（如放射線、化學(xué)致癌物等）的作用下，發(fā)生數(shù)量和結(jié)構(gòu)上的微細(xì)變化，形成了致癌性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因，從而使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。

原癌基因是細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的正常基因，是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必須的，在進(jìn)化上高等保守。

當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強(qiáng)時(shí)，使細(xì)胞過度增殖，從而形成腫瘤。

1、原癌基因原癌基因的特點(diǎn):廣泛存在于生物界中；基因序列高度保守；作用通過其產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)；正常情況下表達(dá)水平很低;被激活后，形成致癌性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因。原癌基因的分類：根據(jù)原癌基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置，可分為：與膜結(jié)合的蛋白，如src基因產(chǎn)物；可溶性蛋白，如mos基因產(chǎn)物；核蛋白，如myc基因產(chǎn)物。根據(jù)原癌基因表達(dá)產(chǎn)物的功能，可分為：蛋白激酶類，如Src家族（酪氨酸蛋白激酶類）生長因子類生長因子受體類GTP結(jié)合蛋白類，如Ras家族核蛋白類（DNA結(jié)合蛋白），如Myc家族未知功能類原癌基因：?jiǎn)慰截?、正常情況下低水平表達(dá)或根本不表達(dá)癌基因？？當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強(qiáng)時(shí)，使細(xì)胞過度增殖，從而形成腫瘤。堿基缺失或單堿基突變基因擴(kuò)增染色體重排蛋白質(zhì)活性大大提高蛋白質(zhì)未變化，但總量大大提高增強(qiáng)子功能使癌基因高效表達(dá)與強(qiáng)啟動(dòng)子基因相融合，提高癌基因表達(dá)效率

原癌基因2、原癌基因的激活機(jī)制（P346）（1）點(diǎn)突變（2）LTR（longterminalrepeat)插入強(qiáng)啟動(dòng)子（3）基因重排（rearrange)（4）缺失（Deletion）oncogene(-)cancer一些原癌基因5’上游存在負(fù)調(diào)控序列，該序列的缺失或突變，則喪失抑制癌基因表達(dá)的能力。Brukitt淋巴瘤中c-myc因負(fù)調(diào)控序列缺失或LTR插入而增強(qiáng)表達(dá)。（5）基因擴(kuò)增

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未變化，但總量大大提高基因擴(kuò)增

原癌基因使每個(gè)細(xì)胞中基因拷貝數(shù)增加，從而直接增加可用的轉(zhuǎn)錄模板數(shù)以增加基因表達(dá)。3、基因互作與癌基因表達(dá)（1）染色體構(gòu)象對(duì)原癌基因表達(dá)的影響基因表達(dá)不僅取決于基因本身及其相鄰區(qū)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)，也取決于其空間構(gòu)象，即基因在染色體上的空間排列和染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。當(dāng)兩個(gè)基因相距太近時(shí)，往往不易形成有利于高效轉(zhuǎn)錄的空間結(jié)構(gòu)?；蝾I(lǐng)域：基因與基因之間的間隔距離基因領(lǐng)域效應(yīng)：同一DNA鏈上兩個(gè)具有相同轉(zhuǎn)錄方向的基因間隔小于一定長度時(shí)，影響有效轉(zhuǎn)錄所必需的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，從而使這兩個(gè)基因中的一個(gè)或兩個(gè)均不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。0.3kb-5kb，最佳間隔距離與兩個(gè)基因的總長度成正相關(guān)。（2）原癌基因終產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控某種原癌基因產(chǎn)物對(duì)另一種原癌基因表達(dá)的調(diào)控作用；某種原癌基因產(chǎn)物對(duì)自身表達(dá)的反饋調(diào)控作用癌基因產(chǎn)物通過介質(zhì)傳遞生長刺激信號(hào)的部位有3處：①癌基因產(chǎn)物本身模擬了生長因子，因而與相應(yīng)的受體作用，以自分泌的方式刺激細(xì)胞生長；②癌基因產(chǎn)物模擬了已結(jié)合配體的生長因子受體，從而在無外源生長因子時(shí)提供了促進(jìn)細(xì)胞分裂的信號(hào)；③癌基因產(chǎn)物作用于細(xì)胞內(nèi)生長控制途徑，解除此途徑對(duì)外源刺激信號(hào)的需求。（3）抑癌基因產(chǎn)物對(duì)原癌基因的調(diào)控抑癌基因(tumorsuppressorgene)

/隱性癌基因：是一種抑制細(xì)胞生長和腫瘤形成的基因。如：Rb抑癌基因、抑癌基因p53抑癌基因與原癌基因在生物學(xué)上有以下幾點(diǎn)差異：①在功能上，抑癌基因起負(fù)調(diào)控作用，而原癌基因起正調(diào)控作用；②在遺傳方式上，原癌基因是顯性的，而抑癌基因在細(xì)胞水平上是隱性的，③在突變發(fā)生的細(xì)胞類型上，抑癌基因突變可以發(fā)生在體細(xì)胞中，也可能發(fā)生在生殖細(xì)胞中并通過生殖細(xì)胞得到遺傳。原癌基因突變只發(fā)生在體細(xì)胞中。（4）外源信號(hào)對(duì)原癌基因表達(dá)的影響

細(xì)胞外信號(hào)（包括生長因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等）作用于靶細(xì)胞后，通過細(xì)胞膜受體系統(tǒng)或其他直接途徑被傳遞至細(xì)胞內(nèi)，再通過多種蛋白激酶的活化，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾，然后引發(fā)一系列基因的轉(zhuǎn)錄激活。第六節(jié)基因治療基因治療的主要途徑基因治療中的病毒載體基因治療中的非病毒載體基因治療（Genetherapy

）

基因治療（Genetherapy

）：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實(shí)施相應(yīng)的策略?；蛑委煂?shí)例1、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。ADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導(dǎo)入細(xì)胞生長分裂

10天

Gene表達(dá)

回輸患兒體內(nèi)

1~2月治療一次,10個(gè)月患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%

2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+FⅨcDNA

重組體

5`LTR

FⅨneoSV

PSO

LTR3`導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達(dá)；91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。3、黑色素瘤的基因治療腫瘤Gene治療是人們十分關(guān)注的問題，進(jìn)行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點(diǎn)協(xié)助治療腫瘤。例：細(xì)胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

導(dǎo)入

TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)

TIL進(jìn)入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。4、自殺基因的基因治療

原理：即用（逆轉(zhuǎn)錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒復(fù)合物，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞不能復(fù)制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達(dá)，而正常細(xì)胞中不表達(dá)。如：自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥物前體無毒Gene→酶→↓

藥物復(fù)合物有毒

細(xì)胞死亡例如：

單純皰疹病毒

哺乳動(dòng)物細(xì)胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，正常細(xì)胞中不表達(dá)）Gene—TKGCV（胸苷類似物）

TdRPp

GCV---p

抑制DNA合成脫氧胸苷酸

腫瘤細(xì)胞死亡鄰近細(xì)胞死亡/凋亡（旁觀者效應(yīng)）一、基因治療的主要途徑1990年第一次利用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把DAA基因?qū)雭硖幓颊叩腡-淋巴細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增后輸回患者體內(nèi)，獲得成功。標(biāo)志站基因治療時(shí)代的開始?；蚬こ膛c基因治療的區(qū)別：宿主表達(dá)——直接表達(dá)可分泌蛋白——所有基因體外完成——人體細(xì)胞exvivo和invivo途徑exvivo:

將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體（異種）細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后輸回人體。這種方法易操作，安全性好，但不易形成規(guī)模。invivo:將外源基因裝配于穩(wěn)定的真核細(xì)胞表達(dá)載體上，直接導(dǎo)入人體內(nèi)。這種方法非常有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，但技術(shù)難度大，安全性必須證明。二、基因治療中的病毒載體基本條件：攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)對(duì)機(jī)體沒有致病力——大多數(shù)野生型病毒對(duì)機(jī)體都有致病性，需要對(duì)其進(jìn)行改造后才能用于人體。病毒載體的產(chǎn)生研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能將外源基因插入病毒基因組的非必需區(qū)將重組病毒進(jìn)行改造——復(fù)制缺陷型——?jiǎng)h除致癌基因——擴(kuò)大容量等病毒載體的分類重組型病毒載體：不改變病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件，有選擇性的刪除病毒的某些必需基因，特別是前早期或早期基因以控制其表達(dá)，所缺失的必需基因的功能由同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞中的外源基因表達(dá)單位提供。一般通過同源重組的方法將目的基因插入到病毒基因組中。無病毒基因的病毒載體：由重組載體和輔助系統(tǒng)組成。重組載體主要由外源基因表達(dá)盒、病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及載體骨架所組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復(fù)制和包裝所必需的反式作用因子。重組載體以特定形式被包裝到不含有任何病毒基因的病毒顆粒中。安全性好、容量大。但會(huì)產(chǎn)生輔助病毒污染。病毒載體在基因治療中的應(yīng)用P379表9-9常用病毒載體的特性和適用范圍基因治療中的問題靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)外源基因表達(dá)的可控性治療基因過少三、基因治療中的非病毒載體裸DNA脂質(zhì)體載體陽離子多聚物型載體1、裸DNA又稱自由DNA，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。困難：如何將目的基因?qū)胂鄳?yīng)的細(xì)胞并得到長期有效的表達(dá)方法：主要通過物理或機(jī)械方法（如直接注射或基因槍法）將DNA導(dǎo)入適當(dāng)部位。DNA疫苗缺點(diǎn)：缺乏靶向性2、脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物脂質(zhì)體：具有雙層膜的封閉式粒子，能促進(jìn)極性大分子穿透細(xì)胞膜。類型：陽離子脂質(zhì)體（最常用？）、陰離子脂質(zhì)體、PH敏感脂質(zhì)體及融合脂質(zhì)體等脂質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、組成對(duì)載體的活性和毒性有很在的影響細(xì)胞主要通過內(nèi)吞途徑攝取脂質(zhì)體，遇到溶酶體即被降解PH敏感脂質(zhì)體在酸性條件下脂肪酸羧基質(zhì)子化，形成六角晶相發(fā)生膜融合。三、多聚物/DNA復(fù)合物DNA帶負(fù)電，利用陽離子多聚體的氨基基團(tuán)的正電荷與DNA的磷酸基團(tuán)結(jié)合發(fā)生電性中和，可以使DNA縮合形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，不易被核酸酶降解，并可防止沉淀，從而提高轉(zhuǎn)染效率?？膳c細(xì)胞表面的帶負(fù)電的受體結(jié)合，能被有效內(nèi)吞攝入，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移合成方便、安全無毒，但組織特異性和靶向性差、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率低。四、DNA微球體白明膠和聚氨基葡萄糖等生物高聚物屬于陽離子復(fù)合物，能與DNA形成大小為200-750nm的微球體復(fù)合物。特點(diǎn)：——可降解——分布均一——共包裝——儲(chǔ)存方便——持續(xù)釋放——毒性低第二節(jié)人免疫缺損病毒——HIVHIV病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)HIV基因組及其編碼的蛋白HIV的復(fù)制P24CapsidproteinP18Matrixprotein一、HIV病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)二、HIV基因組及其編碼的蛋白編碼病毒的核心蛋白編碼反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶編碼外膜蛋白TATandREVareessentialforHIVreplication

GAGgene-p55p17:innersurfacep24:nucleocapsidp9:nucleocapsidassociatedwithRNAPolymerase(reversetranscriptase)2.Integrase3.Protease(cutspolyproteins)

POLgeneMembrane:hostderivedTwoglycoproteins:gp160gp120andgp41gp41isfusogenthatspansthemembranegp120gp41ENVGenecoding三、HIV的復(fù)制TheLifeCycleofHIV1.Virusdestroysthecellasaresultofbudding第三節(jié)乙型肝炎病毒——HBV

一、HBV基因組結(jié)構(gòu)雙鏈部分環(huán)狀結(jié)構(gòu)：兩鏈長短不一短鏈和長鏈的5′端通過240bp配對(duì)維持環(huán)狀結(jié)構(gòu)長鏈(L)完整、恒定，3.2Kb，負(fù)鏈短鏈(S)為正鏈，長度可變，約為長鏈長度的50～80%兩條鏈互補(bǔ)區(qū)兩惻各有一個(gè)11個(gè)堿基的直接重復(fù)序列，稱DR1和DR2二、HBV的復(fù)制dsDNA,不是通過半保留復(fù)制方式復(fù)制第九章疾病與人類健康腫瘤與癌癥人免疫缺陷病毒——HIV乙型肝炎病毒——HBV人禽流感的分子生物學(xué)機(jī)制嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥——SARS的分子機(jī)制基因治療Contents第一節(jié)腫瘤與癌癥內(nèi)容提要：反轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因原癌基因（細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因）產(chǎn)物及其分類原癌基因的表達(dá)調(diào)控基因相互作用與癌基因表達(dá)

癌：是一群不受生長調(diào)控而繁殖的細(xì)胞，也稱惡性腫瘤。良性腫瘤：是一群僅局限在自已的正常位置，且不侵染周圍其他組織和器官的細(xì)胞。細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)：基因突變一、癌基因（oncogene)癌基因的分類病毒癌基因：(virusoncogene,v-onc)DNA病毒(乙肝病毒)、RNA病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒）細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因：(cellular-oncogene,c-onc)原癌基因的突變產(chǎn)物。(一)反轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因（P339）Rous于1910年首先發(fā)現(xiàn)雞肉瘤病毒（后稱勞斯肉瘤病毒RSV），研究證明它是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，接種給雞后可誘發(fā)肉瘤。1966年，85歲的勞斯獲得諾貝爾獎(jiǎng)。1、反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒結(jié)構(gòu)（P339）

調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄

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長末端重復(fù)序列癌基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒表面糖蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶

產(chǎn)生病毒垮膜蛋白2、反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生p60src蛋白質(zhì)，磷酸化蛋白。靶蛋白磷酸化（P341）3、反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制斷裂基因完整的沒有斷裂的可讀框

(二)細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因

細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因?qū)嵸|(zhì)上就是由一類原癌基因突變而來。當(dāng)原癌基因在某些外界因素（如放射線、化學(xué)致癌物等）的作用下，發(fā)生數(shù)量和結(jié)構(gòu)上的微細(xì)變化，形成了致癌性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因，從而使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。

原癌基因是細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的正?；?，是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必須的，在進(jìn)化上高等保守。

當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強(qiáng)時(shí)，使細(xì)胞過度增殖，從而形成腫瘤。

1、原癌基因原癌基因的特點(diǎn):廣泛存在于生物界中；基因序列高度保守；作用通過其產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)；正常情況下表達(dá)水平很低;被激活后，形成致癌性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因。原癌基因的分類：根據(jù)原癌基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置，可分為：與膜結(jié)合的蛋白，如src基因產(chǎn)物；可溶性蛋白，如mos基因產(chǎn)物；核蛋白，如myc基因產(chǎn)物。根據(jù)原癌基因表達(dá)產(chǎn)物的功能，可分為：蛋白激酶類，如Src家族（酪氨酸蛋白激酶類）生長因子類生長因子受體類GTP結(jié)合蛋白類，如Ras家族核蛋白類（DNA結(jié)合蛋白），如Myc家族未知功能類原癌基因：?jiǎn)慰截?、正常情況下低水平表達(dá)或根本不表達(dá)癌基因？？當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強(qiáng)時(shí)，使細(xì)胞過度增殖，從而形成腫瘤。堿基缺失或單堿基突變基因擴(kuò)增染色體重排蛋白質(zhì)活性大大提高蛋白質(zhì)未變化，但總量大大提高增強(qiáng)子功能使癌基因高效表達(dá)與強(qiáng)啟動(dòng)子基因相融合，提高癌基因表達(dá)效率

原癌基因2、原癌基因的激活機(jī)制（P346）（1）點(diǎn)突變（2）LTR（longterminalrepeat)插入強(qiáng)啟動(dòng)子（3）基因重排（rearrange)（4）缺失（Deletion）oncogene(-)cancer一些原癌基因5’上游存在負(fù)調(diào)控序列，該序列的缺失或突變，則喪失抑制癌基因表達(dá)的能力。Brukitt淋巴瘤中c-myc因負(fù)調(diào)控序列缺失或LTR插入而增強(qiáng)表達(dá)。（5）基因擴(kuò)增

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)未變化，但總量大大提高基因擴(kuò)增

原癌基因使每個(gè)細(xì)胞中基因拷貝數(shù)增加，從而直接增加可用的轉(zhuǎn)錄模板數(shù)以增加基因表達(dá)。3、基因互作與癌基因表達(dá)（1）染色體構(gòu)象對(duì)原癌基因表達(dá)的影響基因表達(dá)不僅取決于基因本身及其相鄰區(qū)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)，也取決于其空間構(gòu)象，即基因在染色體上的空間排列和染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。當(dāng)兩個(gè)基因相距太近時(shí)，往往不易形成有利于高效轉(zhuǎn)錄的空間結(jié)構(gòu)。基因領(lǐng)域：基因與基因之間的間隔距離基因領(lǐng)域效應(yīng)：同一DNA鏈上兩個(gè)具有相同轉(zhuǎn)錄方向的基因間隔小于一定長度時(shí)，影響有效轉(zhuǎn)錄所必需的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，從而使這兩個(gè)基因中的一個(gè)或兩個(gè)均不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。0.3kb-5kb，最佳間隔距離與兩個(gè)基因的總長度成正相關(guān)。（2）原癌基因終產(chǎn)物對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控某種原癌基因產(chǎn)物對(duì)另一種原癌基因表達(dá)的調(diào)控作用；某種原癌基因產(chǎn)物對(duì)自身表達(dá)的反饋調(diào)控作用癌基因產(chǎn)物通過介質(zhì)傳遞生長刺激信號(hào)的部位有3處：①癌基因產(chǎn)物本身模擬了生長因子，因而與相應(yīng)的受體作用，以自分泌的方式刺激細(xì)胞生長；②癌基因產(chǎn)物模擬了已結(jié)合配體的生長因子受體，從而在無外源生長因子時(shí)提供了促進(jìn)細(xì)胞分裂的信號(hào)；③癌基因產(chǎn)物作用于細(xì)胞內(nèi)生長控制途徑，解除此途徑對(duì)外源刺激信號(hào)的需求。（3）抑癌基因產(chǎn)物對(duì)原癌基因的調(diào)控抑癌基因(tumorsuppressorgene)

/隱性癌基因：是一種抑制細(xì)胞生長和腫瘤形成的基因。如：Rb抑癌基因、抑癌基因p53抑癌基因與原癌基因在生物學(xué)上有以下幾點(diǎn)差異：①在功能上，抑癌基因起負(fù)調(diào)控作用，而原癌基因起正調(diào)控作用；②在遺傳方式上，原癌基因是顯性的，而抑癌基因在細(xì)胞水平上是隱性的，③在突變發(fā)生的細(xì)胞類型上，抑癌基因突變可以發(fā)生在體細(xì)胞中，也可能發(fā)生在生殖細(xì)胞中并通過生殖細(xì)胞得到遺傳。原癌基因突變只發(fā)生在體細(xì)胞中。（4）外源信號(hào)對(duì)原癌基因表達(dá)的影響

細(xì)胞外信號(hào)（包括生長因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等）作用于靶細(xì)胞后，通過細(xì)胞膜受體系統(tǒng)或其他直接途徑被傳遞至細(xì)胞內(nèi)，再通過多種蛋白激酶的活化，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾，然后引發(fā)一系列基因的轉(zhuǎn)錄激活。第六節(jié)基因治療基因治療的主要途徑基因治療中的病毒載體基因治療中的非病毒載體基因治療（Genetherapy

）

基因治療（Genetherapy

）：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實(shí)施相應(yīng)的策略?；蛑委煂?shí)例1、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。ADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導(dǎo)入細(xì)胞生長分裂

10天

Gene表達(dá)

回輸患兒體內(nèi)

1~2月治療一次,10個(gè)月患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%

2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+FⅨcDNA

重組體

5`LTR

FⅨneoSV

PSO

LTR3`導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達(dá)；91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。3、黑色素瘤的基因治療腫瘤Gene治療是人們十分關(guān)注的問題，進(jìn)行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點(diǎn)協(xié)助治療腫瘤。例：細(xì)胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

導(dǎo)入

TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)

TIL進(jìn)入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。4、自殺基因的基因治療

原理：即用（逆轉(zhuǎn)錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒復(fù)合物，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞不能復(fù)制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達(dá)，而正常細(xì)胞中不表達(dá)。如：自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥物前體無毒Gene→酶→↓

藥物復(fù)合物有毒

細(xì)胞死亡例如：

單純皰疹病毒

哺乳動(dòng)物細(xì)胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，正常細(xì)胞中不表達(dá)）Gene—TKGCV（胸苷類似物）

TdRPp

GCV---p

抑制DNA合成脫氧胸苷酸

腫瘤細(xì)胞死亡鄰近細(xì)胞死亡/凋亡（旁觀者效應(yīng)）一、基因治療的主要途徑1990年第一次利用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把DAA基因?qū)雭硖幓颊叩腡-淋巴細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增后輸回患者體內(nèi)，獲得成功。標(biāo)志站基因治療時(shí)代的開始?；蚬こ膛c基因治療的區(qū)別：宿主表達(dá)——直接表達(dá)可分泌蛋白——所有基因體外完成——人體細(xì)胞exvivo和invivo途徑exvivo:

將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體（異種）細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后輸回人體。這種方法易操作，安全性好，但不易形成規(guī)模。invivo:將外源基因裝配于穩(wěn)定的真核細(xì)胞表達(dá)載體上，直接導(dǎo)入人體內(nèi)。這種方法非常有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，但技術(shù)難度大，安全性必須證明。二、基因治療中的病毒載體基本條件：攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)對(duì)機(jī)體沒有致病力——大多數(shù)野生型病毒對(duì)機(jī)體都有致病性，需要對(duì)其進(jìn)行改造后才能用于人體。病毒載體的產(chǎn)生研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能將外源基因插入病毒基因組的非必需區(qū)將重組病毒進(jìn)行改造——復(fù)制缺陷型——?jiǎng)h除致癌基因——擴(kuò)大容量等病毒載體的分類重組型病毒載體：不改變病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件，有選擇性的刪除病毒的某些必需基因，特別是前早期或早期基因以控制其表達(dá)，所缺失的必需基因的功能由同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞中的外源基因表達(dá)單位提供。一般通過同源重組的方法將目的基因插入到病毒基因組中。無病毒基因的病毒載體：由重組載體和輔助系統(tǒng)組成。重組載體主要由外源基因表達(dá)盒、病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及載體骨架所組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復(fù)制和包裝所必需的反式作用因子。重組載體以特定形式被包裝到不含有任何病毒基因的病毒顆粒中。安全性好、容量大。但會(huì)產(chǎn)生輔助病毒污染。病毒載體在基因治療中的應(yīng)用P379表9-9常用病毒載體的特性和適用范圍基因治