(高清版)DB43∕T 953-2014 茄科蔬菜病毒病綠色防控技術操作

ofthesolanaceaevegetablevirusdiseases2014-10-21發(fā)布2014-11-20實施湖南省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I前言 Ⅱ 1 13術語和定義 4發(fā)生流行規(guī)律 4.1接觸傳染病毒病流行規(guī)律 24.2蟲傳病毒病流行規(guī)律 25病害診斷 25.1病害田間診斷 25.2生物學檢測 2 25.4分子生物學檢測 2 27防治方法 37.1種苗防治 37.2農業(yè)防治 3 4 47.5農藥防治 5 59建立防治檔案 5附錄A(資料性附錄)茄科蔬菜病毒病癥狀 6附錄B(規(guī)范性附錄)病毒病生物學、血清、分子生物學檢測 7附錄C(規(guī)范性附錄)農藥防治傳毒害蟲及病毒病一覽表 附錄D(資料性附錄)茄科蔬菜病毒病防治檔案 ⅡDB43/T953—2014本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由湖南省植物保護研究所提出。本標準由湖南省農業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：湖南省植物保護研究所。本標準主要起草人：劉勇、張德詠、張卓、黃志龍、譚新球、文吉輝、孫淑娥、張宇、羅路云。11范圍本標準規(guī)定了茄科蔬菜病毒病的術語和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、本標準適用于辣椒、番茄、茄子等茄科蔬菜病毒病的綠色防控。2規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。農藥安全使用標準農藥合理使用準則瓜菜作物種子茄果類綠色食品農藥使用準則3術語和定義綠色防控技術Greencontroltechnical物防治、物理防治和科學用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術來控制農作物病蟲害的植物保護措施。某些病毒亦可在發(fā)病植株殘體中長期存活；病毒在植物體內進行核酸(RNA或DNA)和蛋白外殼復制并4發(fā)生流行規(guī)律與帶毒害蟲的傳播有關。病毒病由液汁接觸和傳毒害24.1接觸傳染病毒病流行規(guī)律病毒可在多種植物上越冬，病殘體、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源，此外，結、排水不良和偏施氮肥都會加重病情發(fā)展。4.2蟲傳病毒病流行規(guī)律黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒主要通過蚜蟲和煙粉虱等介體傳播，在溫室大棚較高適合蚜蟲和煙粉虱生長繁殖，導致病毒病常年發(fā)生；在湖南地區(qū)無設施栽培在4月初進行大田定植，由于溫度較低，不適合蚜蟲、煙粉虱生長、繁殖，田間未見通過蟲傳病毒病植株；田間蟲傳病毒病植株開始于5月底6月初，剛開始發(fā)病時田間有少量的蚜蟲、煙粉虱，隨著溫度的上升降雨量減少，特別是8月~9月的高溫干旱天氣，適合蚜蟲、煙粉虱的生長、發(fā)育和繁殖，田間出現(xiàn)了大量的蚜蟲、煙粉虱，隨著蚜蟲和煙粉虱的遷移，田間茄科蔬菜大面積的5.1病害田間診斷茄科蔬菜病毒病的危害癥狀有三種表現(xiàn)癥狀：葉片出現(xiàn)濃綠和淡綠色相同的花斑，幼苗表現(xiàn)矮縮，新葉略曲扭，成株不矮縮，新葉表現(xiàn)花葉，稱為花葉型。有的葉片狹長呈線狀，色淡卷曲，節(jié)間縮短，稱條紋型(參見附錄A圖A1、A2)。5.2生物學檢測用于生物學檢測病毒的常用鑒別寄主植物有心葉煙、三生煙、本氏煙、莧用摩擦接種的方法對病毒進行接種培養(yǎng)。具體方法和檢測結果見附錄B.15.3血清學檢測(Dot-ELISA檢測)在進行生物學檢測的同時也使用血清學的方法對所采樣品進行檢測。具體方法和檢測結果見附錄5.4分子生物學檢測 (RT),轉錄合成cDNA鏈，電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴增片段與預期目標條帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒見附錄B.3。6防治原則3降低病蟲害暴發(fā)幾率，積極保護利用自然天低毒、低殘留和低污染的農藥，將病蟲危害損失降到最低限度。7防治方法選用抗病、避病、優(yōu)質適合當?shù)卦耘鄺l件的各類符合國家種子質量的品種。7.1.2種子脫毒、消毒茄科蔬菜種子播種前選擇晴天將種子曬(2～3)d,利用太陽紫外線殺死附著在種子表面的病原菌，用55℃溫開水侵泡種子0.5h左右，搓去種子表面粘液，用10%的磷酸三鈉溶液浸種0.5h左右，撈出后用干凈清水沖洗3次催芽。育苗前，徹底清除苗床枯枝殘葉和雜草，深耕土壤30cm左右，邊耕邊撒上生石灰和百菌清進行土壤消毒，并把土塊敲碎整理好成高畦，最后用(400～600)倍高錳酸鉀溶液噴灑土壤，然后蓋好朔料薄膜覆蓋密封苗床7d左右再播種，苗床采用50目以上的銀灰色防蟲網進行覆蓋，用來阻止蚜蟲、煙粉虱等傳毒害蟲的侵入，控制由傳毒害蟲傳播而導致的病毒病的發(fā)生；在育苗床上使用頻振式殺蟲燈誘蟲、7.2.1合理輪作倒茬理布局和輪作，對茄科蔬菜實行2～3年以上輪作倒茬。時摘除病蟲為害的葉片、果實或整株拔除，帶出田外深埋叉、農田除草或其他農作時應減少對作物的機械損傷，防止操作病毒病傳播。使土壤疏松，有利于植物根系發(fā)育，提高植47.2.5土壤消毒定植前，徹底清除田間枯枝殘葉和雜草，深耕土壤，邊耕邊撒上把土塊敲碎整理好成高畦，最后用(400～600)倍高錳酸鉀溶液噴灑土壤，然后蓋好朔料薄膜覆蓋密封田塊7d左右再定植。作物育苗或田間種植時用40目以上的防蟲網構建人工隔離屏障，能夠很好的防止傳毒害蟲對防蟲網內作物的傳毒，朔料薄膜全程覆蓋生產技菜安全越夏，朔料薄膜的使用不僅在冬季能保溫，也可以阻隔降雨危害，確保蔬小行高畦，行與行之間挖一條深(10~15)cm,寬(15～20)cm的溝，以利于排水?？茖W配方施肥，改善土壤的理化性質和營養(yǎng)狀況，促進植物健壯成長，增加其對噴施鈣肥、硅肥等微量元素或在作物的不同生育期噴施300倍益農光合細菌菌劑誘導植物對病毒病的抗性。能減少化學農藥的使用次數(shù)和用量，降低農藥對環(huán)境的污染。科學管水7.3物理防治7.3.1燈光誘殺使用頻振式殺蟲燈、氖氣燈或誘蟲燈等誘殺傳毒害蟲。蔬菜園一般每30畝安裝1盞燈。采用頻振式殺蟲燈及太陽能殺蟲燈誘殺害蟲。此裝置是利用害蟲的趨光、趨波、波段、波的頻率設定在特定的范圍內，近距離用光，遠距離用波，加上害蟲本撲燈，燈外配以頻陣高壓電網，害蟲觸電后達到誘殺成蟲的目的。安裝時燈底部距離地面1.20m,于蔬在作物育苗或田間種植時用40目以上的防蟲網能夠很好的防止傳毒害蟲對防蟲網內作物的傳毒。在春季和秋季蚜蟲發(fā)生期，用銀灰色地膜覆蓋栽培蔬菜或懸掛銀灰色膜條，每畝(30～40)條，可7.3.4色板誘殺利用蚜蟲、薊馬、煙粉虱等成蟲對黃色或綠色有較強趨性的特性，在田間放置30cm×40cm的誘蟲黃板或綠板300塊/hm2,將黃板或綠板呈棋盤式均勻插置田間，黃板或綠板底部略高出植株頂端20cm左右，黃板或綠板粘滿害蟲后及時更換。7.4生物防治保護田間有益昆蟲，利用生物多樣性控制傳毒害蟲。5田間釋放瓢蟲、草蛉等捕食性天敵和麗蚜小蜂等寄生性天敵防治蚜蟲、薊馬、煙粉虱等傳毒害蟲。7.4.3生防菌防控利用蚜霉菌、蠟蚜輪枝菌、1.8%阿維菌素乳油、木霉菌等生防菌株防治傳毒害蟲。在上述措施無法控制在病毒病和傳毒害蟲經濟閥值以下，且病毒病和傳毒害蟲出現(xiàn)大面積爆發(fā)時，采用農藥防治。農藥使用應符合國家綠色食品農采用高效、低毒、低殘留農藥防治病毒病，防治病毒病常用藥劑的用量及用法見附錄C。通過切斷傳毒介體的傳播途徑，來控制茄科類蔬菜病毒病發(fā)生具有重要作用。蔬菜定植后(1~3)d,將25%噻蟲嗪水分散粒劑稀釋(1000~1500)倍液按每株50ml灌根處理，對傳毒害蟲進行預防。交替使用，同一藥劑不得連續(xù)施用2次；茄科蔬菜病毒病主要傳毒介體有蚜蟲、煙粉虱等害蟲。a)蚜蟲農藥防治當田間有蟲率(5～15)%時開始用藥，優(yōu)先采用植物源農藥，防治蚜蟲常用藥劑的用量及用法見附錄C。b)煙粉虱農藥防治當田間有蟲率(10～15)%時開始用藥，優(yōu)先采用植物源農藥，防治煙粉虱常用藥劑的用量及用法見附錄C。建立茄科蔬菜病毒病防治檔案，具體檔案記錄表格見附錄D。6附錄A(資料性附錄)茄科蔬菜病毒病的危害癥狀有三種表現(xiàn)癥狀：葉片出現(xiàn)濃綠和淡綠色相同的花斑，幼苗表現(xiàn)矮縮，新葉略歪扭，成株不矮縮，新葉表現(xiàn)花斑，稱為花葉型。有的葉片狹長呈線狀，色淡卷曲，節(jié)間縮短，圖A1辣椒病毒病為害癥狀圖A2番茄病毒病為害癥狀7附錄B(規(guī)范性附錄)B.1病毒生物學檢測B.1.1病毒摩擦接種方法400)目撒到待接種葉的表面(也可直接將金剛砂加在研磨液中),在營養(yǎng)缽內插上標簽，注明處理及時間；用手指或研棒、棉球和紗布蘸取少許汁接過種的葉片，將植株放于溫室(最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對照；接種后的純化，將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液接種的方法斑點剪下，用接種緩沖液研磨再次接種至枯斑寄主，出現(xiàn)單斑癥狀后再次取下單現(xiàn)斑點后再取單個斑點接種于系統(tǒng)寄主，出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后再取葉片進行保存和檢測。B.1.2病毒的保存干燥的方法處理后，寫明標簽，存于-80℃冰箱。將經分離純化后得到的不同病毒的病毒分離物分別接圖B1CMV分離物接種至莧色藜上的癥狀(a):枯斑；接種至心葉煙上的癥狀(b):系統(tǒng)花葉。圖B2TMV分離物接種至心葉煙上的癥狀(a):枯斑；接種至三生煙上的癥狀(b):系統(tǒng)花葉。8B.2病毒的血清檢測植物葉片稱重后，按重量體積比1:10~1:50(g/ml)加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm離心3min;取2ul上清點到硝酸纖維素膜(NC膜);室溫干燥10min;NC膜浸入到含5%脫脂奶粉室溫封閉30min;NC膜放入5%的脫脂奶粉1:5000倍稀釋的單抗中室溫孵育(30～60)min;PBST洗膜(3~4)次，每次3min;NC膜放入用5%的脫脂奶粉1:8000倍稀釋的堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG二抗wholemolecule中室溫孵育(30～60)min;PBST洗膜(4~5)次，每次5min;最后一遍再用PBS洗5min。顯色底物NBT66ul和BCIP33ul加到10ml底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時終止反應(顯色5～20min),即在自來水中漂洗一下，肉眼觀察并記錄結果見圖B3。圖B3CMV和TMV分離物的Dot-ELISA檢測結果B.3分子生物學檢測B.3.1GB溶液配方采用硅粒吸附法提取植物總RNA。取病葉0.1g,加3mLGB溶液，研磨至勻漿；取500μL研磨液，加100μLNLS,70℃溫育10min,不時上下顛倒混勻，冰上放置5min,13000/min離心10min;取300離心1min,倒去上清；加500μL洗滌液(WB:無水乙醇=1:1)洗滌，6000/min離心1min,倒掉上清，重復該步驟；沉淀加ddH?O150μL,70℃溫育4min,1min后將離心管蓋打開，隨即蓋上；13000/min離心3min,取上清，-20℃保存。B.3.3RT-PCR擴增B.3.3.1反轉錄反轉錄試劑盒購自全氏金，以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機引物進行反轉錄(RT),轉錄合成cDNA鏈具體反應體系及步驟見表B.1。9上述混合液25℃孵育10min,42℃孵育30min,85℃加熱5min,-20℃保存。名稱(前引/后引)引物序列片段長度ATTTAAGTGGASGGAAAAVC(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=G或C;Y=C或T;R=A或G;B=G,C或T)前引后引酶反應程序94℃預變性4min,94℃,45s;57℃,45s;72℃,Imin,35個循環(huán)；72℃延伸7min。94℃預變性4min,94℃,45s;55℃,45s;72℃,1min,35個循環(huán)；72℃延伸7miB.3.4瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5HL擴增反應物與2mLSYBRGreen染料、3mLloadingbuffer混勻，電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴增片段與預帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒見附錄圖B.4、B.5。圖B.4茄科作物攜帶CMV的檢測圖B.5茄科作物攜帶TMV的檢測DB43/T953—2014附錄C(規(guī)范性附錄)防治農藥安全間隔期(天)防治時期1.5%植物靈乳劑770.5%大黃素甲醚水劑1000倍液720%鹽酸嗎啉胍.乙酸銅71000倍噴霧70.