AAV的包裝純化濃縮方法總結(jié)

AAV的包裝純化濃縮方法總結(jié)腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus，AAV）,也稱腺伴隨病毒,屬于微小病毒科依賴病毒屬,是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復(fù)制。它編碼兩個(gè)末端的反向重復(fù)序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs對于病毒的復(fù)制和包裝具有決定性作用。cap基因編碼病毒衣殼蛋白，

rep基因參與病毒的復(fù)制和整合。AAV能感染多種細(xì)胞。rep基因產(chǎn)物存在時(shí)，病毒DNA很容易整合到人類第19號染色體。重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)

源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣(分裂和非分裂細(xì)胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長等特點(diǎn)，被視為有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。經(jīng)過10余年的研究，重組腺相關(guān)病毒的生物學(xué)特性己被深入了解，尤其是其在各種細(xì)胞、組織和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果方面已經(jīng)積累了許多資料。在醫(yī)學(xué)研究中，rAAV被用于多種疾病的基因治療的研究(包括體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn))；同時(shí)作為一種有特點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)移載體，還廣泛用于基因功能研究、構(gòu)建疾病模型、制備基因敲除鼠等方面。實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備HEK293T細(xì)胞：提前一天分HEK293T細(xì)胞，包裝時(shí)細(xì)胞密度85%-90%且細(xì)胞分布均勻，狀態(tài)良好(即：顯微鏡下觀察，培養(yǎng)基中無雜質(zhì)，無細(xì)胞懸浮或有少量細(xì)胞懸浮，細(xì)胞飽滿，在培養(yǎng)皿中貼壁均勻)。2、包裝病毒1）提前一到兩個(gè)小時(shí)給細(xì)胞換液，換成無血清的DMEM培養(yǎng)基（1%HEPES和1%P/S）。換液時(shí)移液管要靠近培養(yǎng)皿內(nèi)壁但不要貼住培養(yǎng)皿內(nèi)壁緩慢加入DMEM，防止將已經(jīng)貼壁的細(xì)胞吹起，同時(shí)換液時(shí)應(yīng)注意避免移液管污染換液用培養(yǎng)基及細(xì)胞。2）轉(zhuǎn)染：以5個(gè)15cm培養(yǎng)皿的量為例：向15ml離心管中依次加入DMEM:9ml，Helper:124μg，RC:76μg，目的質(zhì)粒：65.1μg，PEI:1ml，振蕩混勻后室溫靜置30min。輔助質(zhì)粒和目的質(zhì)粒需要根據(jù)其濃度換算出所需的體積，在加入之前要振蕩混勻。3）將上述靜置后的液體平均加到5盤HEK293T細(xì)胞中并做好標(biāo)記，加入時(shí)同樣要貼壁緩慢加入，避免將細(xì)胞吹起，加入后搖晃混勻（水平十字混勻）。將細(xì)胞至于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4）觀察轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染后24h觀察轉(zhuǎn)染效率，一般為60%-70%左右，看看所需熒光是否正確。3、收毒1）將細(xì)胞吹起，連同培養(yǎng)基一并收到50ml離心管中，每5盤細(xì)胞收集到3個(gè)50ml離心管中，平均每管45ml,3500rpm(2100g)常溫離心7min。2）將培養(yǎng)基上清轉(zhuǎn)移到新管中，PEG8000沉淀過夜（每100mL加入2.33gNaCl+8.5gPEG8000），第二天離心3500g、4℃離心30min，棄掉上清（離心后馬上棄去上清，防止病毒回溶），用2mlPBS+0.001%PF68

重懸。3）將細(xì)胞沉淀用PBS+0.001%PF685ml重懸，凍融一次后加入5MNacl

（高壓滅菌）2ml，渦旋混勻。4）將2）的重懸液與3）的重懸液混合，振蕩混勻后超聲至不粘稠，超聲時(shí)不同樣品之間探頭要依次經(jīng)過84（用無菌水稀釋10倍），75%酒精，滅菌水的清洗，超聲30s停8~10s，根據(jù)樣品的粘稠度不同AMPL30％超3-4次，AMPL20％超一次（用粗的探頭）。轉(zhuǎn)換超聲強(qiáng)度是因?yàn)楫?dāng)用AMPL30%超聲3-4次不粘稠后，如果再用30%的強(qiáng)度超聲一次可能會因強(qiáng)度過強(qiáng)對病毒活性有一定的影響，換用20%AMPL

超聲一次可以使超聲更加充分。5）將超聲后的液體3500g、4℃

離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。4、純化：碘克沙醇密度梯度離心1）按如下的比例配置不同濃度的碘克沙醇。（用滅菌水配制60%碘克沙醇w/v,并用0.2μm的濾膜過濾至滅過菌的瓶中）層數(shù)60%碘克沙醇(ml)5MNacl(ml)H2O(ml)2.5MKCl(μl)1MMgCl2(μl)10×PBS(ml)Total(ml)每管用量（ml）15%25204510010010100925%41.7048.310010010100640%66.7023.310010010100560%1000010010001004.2

2）取一個(gè)超離管（超離管和蓋子均高壓滅菌后使用），逐層加入不同濃度的碘克沙醇。先加入60%層4.2ml，再加入40%層5ml，其次加入25%層6ml，后加入15%層9ml。加入不同濃度的碘克沙醇時(shí)要傾斜離心管并緩慢推入，避免串層，尤其是加入15%層時(shí)，由于濃度為15%與25%的碘克沙醇密度差距小，15%層很容易與25%層混合。整個(gè)操作需要在生物安全柜里進(jìn)行。3）將處理好的粗病毒液加入到上層，加入病毒時(shí)尤其開始要小心緩慢加入，切忌猛地將病毒推入至管中，并將管蓋蓋好。4）超速離心:

離心前應(yīng)將相對的超離管配平，誤差控制在0.1g以內(nèi)（一般控制在0.02g以內(nèi)），轉(zhuǎn)子選擇VTi50,48000rpm4℃離心2.5h。轉(zhuǎn)速達(dá)到規(guī)定轉(zhuǎn)速后才可離開，超速離心完成后將轉(zhuǎn)子放至4℃冰箱。冬天溫度過低或夏天溫度高時(shí)，均應(yīng)將空調(diào)打開升溫或降溫，冬天溫度過低時(shí)，室溫低于10℃時(shí)，超速離心機(jī)抽真空泵工作報(bào)錯(cuò)，夏天室溫過高時(shí)，會使離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的熱量難以散發(fā)影響離心機(jī)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。5.

濃縮1）離心完畢后，將超濾管底用10ml注射器用的針頭（單獨(dú)訂購的針頭）刺破，棄掉滴下的前兩毫升，收集第三毫升到第六或七毫升。使用過的針頭需要用原來的針頭蓋蓋好，并置于專門的裝有84的瓶子中，集中丟棄，避免人員被針頭刺到。2）由于超聲這一步及在用NaCl將和PEG8000沉淀上清中的病毒時(shí)，都有染菌的可能性，因此收集的四或五毫升液體需先用1X的雙抗37℃處理1小時(shí)，用PBS+0.001%PF68稀釋至15ml，用0.2μm的濾膜過濾，以達(dá)到除菌的目的。3）將過濾后的液體置于15ml的超濾管(100KD)中，3500rcf,4℃離心30min。如果體積還不到理想體積，需要將離下去的液體棄掉，向超濾管中加入PBS+0.001%PF68稀釋，再次離心。每次離心前均需將超濾管中液體顛倒混勻，配平后進(jìn)行離心，相差0.1g以內(nèi)，盡量在0.02g以內(nèi))。時(shí)間長短可以根據(jù)溶液的粘稠程度而定。（不論第一次凝縮離心后管中剩多少液體都應(yīng)用PBS+0.001%PF68稀釋后再離心一次，防止碘克沙醇及酚紅殘留過多）4）將超濾管中剩下的液體反復(fù)吹打后吸至病毒儲存管中，將一定體積的PBS+0.001%PF68加入至濃縮管中，反復(fù)吸打混勻后將液體吸出,一般情況下AAV濃縮離心完成后將剩余的液體吸出后用PBS+0.001%PF68

洗兩次，每次用PBS+0.001%PF68150μl左右，一般清洗時(shí)小體積為100μl,體積太小容易在反復(fù)吸打的過程中產(chǎn)生氣泡影響病毒的收集，終在病毒收集管管壁標(biāo)明名稱和日期。即使離心后濃縮管中剩余的病毒體積與合同要求體積相近，也應(yīng)用100μl的PBS+0.001%PF68清洗一遍。5）吸10μl病毒液進(jìn)行滴度檢測，滴度檢測完成后將滴度標(biāo)至管壁。

注意事項(xiàng)：1、第一次病毒包裝滴度不夠：首先加包裝盤數(shù)；若第二次包裝滴度仍然不夠，要對該目的基因功能進(jìn)行分析，很有可能是目的基因的問題。2、純化灌柱子時(shí)，在加60%層碘克沙醇時(shí)可迅速加入，只吸4.2ml即可，在加入其它層時(shí)，移液管中吸取的液體要比要求加入的液體體積多1ml,防止將后一點(diǎn)液體加至離心管中時(shí)將下層沖散。灌注時(shí)將管子傾斜，但是不要讓下層的液體傾斜至管口下緣頂，要有一小段距離，否則容易串層。3、濃縮時(shí)反復(fù)吸打