食品微生物檢驗(yàn)及2010國標(biāo)(精)

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)及國標(biāo)GB4789-2010

總則、菌落總數(shù)、霉菌酵母菌計(jì)數(shù)、商業(yè)無菌

大腸菌群計(jì)數(shù)

沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法

其他致病菌內(nèi)容提要食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)指示菌概念:在常規(guī)安全衛(wèi)生監(jiān)測中，用以指示檢樣衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物類型：一般性、特定性（如糞便污染）、其他項(xiàng)目：菌落總數(shù)、大腸菌群、耐熱大腸菌群、總大腸菌群食源性致病菌及其毒素沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、溶血性鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲菌、致病性大腸埃希氏菌等霉菌酵母菌及其毒素黃曲霉毒素B1、B2等其他項(xiàng)目抗生素殘留、beta-內(nèi)酰胺酶、商業(yè)無菌等菌落總數(shù)的意義反映食品被細(xì)菌污染的程度預(yù)測食品耐放程度和時(shí)間估測食品腐敗狀況實(shí)際上是把檢樣中得致病菌、非致病菌、酵母菌、霉菌都計(jì)算在內(nèi)的微生物雜菌總數(shù)由于傾注平板法的局限，會(huì)有一部分細(xì)菌在該實(shí)驗(yàn)條件下不生長，故計(jì)數(shù)結(jié)果要比實(shí)際值低GB/T4789.2-2010菌落總數(shù)操作流程圖提示：若樣品中可能含有表面蔓延生長的菌落時(shí)，可在培基凝固后再覆蓋一薄層培基水產(chǎn)品置于30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。菌落總數(shù)的幾個(gè)概念菌落總數(shù)：AerobicPlateCount，食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培基、溫度、時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等）所得1mL（g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。只包括一群在平板技術(shù)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)不等于細(xì)菌總數(shù)。菌落：Colony，單個(gè)微生物在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度；形成肉眼可見有一定形態(tài)細(xì)菌群落。CFU:ColonyFormingUnits，菌落形成單位菌落計(jì)數(shù)方法有較大片狀菌落生長者不宜采用，若片狀小于平板一半時(shí)且余部均勻分布，則以半個(gè)平板菌落數(shù)2倍報(bào)告無明顯界限鏈狀菌落每條單鏈視為一個(gè)菌落選取菌落數(shù)在30~300cfu之間，無蔓延生長的平板計(jì)數(shù)低于30的記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)，每個(gè)稀釋度采用兩個(gè)平行的均數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果的表述若只有一個(gè)稀釋度平板在30~300CFU，則計(jì)算兩平行平板的均數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之若有連續(xù)兩個(gè)稀釋度符合計(jì)數(shù)要求則按下公式例1：10-2=232，24410-3=33，35例2：10-1=232，24410-2=33，29

菌落總數(shù)所有符合計(jì)數(shù)要求的平板菌落數(shù)之和較低稀釋度有效平板數(shù)較高稀釋度有效平板數(shù)較低稀釋度的稀釋倍數(shù)N=(232+244+33+35)(2+2×0.1）×10-1新計(jì)數(shù)公式的統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)平板菌落數(shù)越多，結(jié)果越具有代表性（不考慮稀釋倍數(shù)和培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況等）取樣量越大，結(jié)果越具有代表性（同等取樣條件、排除其他方面的干擾因素）不同的取樣量賦予不同的權(quán)重，而不是簡單的取平均值。新舊方法計(jì)算同一結(jié)果會(huì)有所不同結(jié)果表述10-1均數(shù)10-2均數(shù)描述最終結(jié)果25536均在30~300間則按計(jì)數(shù)公式2.6×103多不可計(jì)345各平板均>300，取稀釋度最高者報(bào)告，余計(jì)為多不可數(shù)3.5×104122均小于30則取稀釋度最低者報(bào)告1.2×10233029所有平板均不在30~300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者報(bào)告2.9×10300所有平板均無菌落則記為1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告1×10，10報(bào)告方式菌落數(shù)在100cfu內(nèi)時(shí)按四舍五入修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)四舍五入修約，取前兩位數(shù)字，例：20504321000or2.1×105所有平板均為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)者報(bào)告菌落蔓延若空白對照有菌落則此次檢測結(jié)果無效固體樣品以cfu/g，液體以cfu/mL為單位GB/T4789.15-2010霉菌酵母菌計(jì)數(shù)基本過程類似菌落總數(shù)所用培養(yǎng)基為孟加拉紅、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）稀釋液為無菌蒸餾水培養(yǎng)溫度為25~28度，時(shí)間為5天計(jì)數(shù)方法：選擇10~150cfu的平板報(bào)告之，余規(guī)則同菌落總數(shù)霉菌和酵母菌的食品衛(wèi)生學(xué)意義霉菌酵母菌可使食品和糧食發(fā)生霉變，常在低pH、低濕度、高鹽、高糖含量食品中出現(xiàn)低溫貯存的或含抗生素的食品亦可出現(xiàn)霉菌酵母菌能合成有毒代謝物引起各種急慢性中毒，特別某些霉菌毒素強(qiáng)烈致癌作為評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌，判定食品被其污染程度，便于對檢樣進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價(jià)典型霉菌酵母菌菌落形態(tài)觀賞酵母菌菌落多類似細(xì)菌菌落，但大而厚，濕潤、粘稠、易挑起，某些菌種長時(shí)間培養(yǎng)而呈皺縮狀。顏色多為乳白、少數(shù)紅色。霉菌菌絲粗長，其菌落疏松，呈絨毛狀、棉絮狀或蛛網(wǎng)狀。有的菌落呈圓形，有的無定形。由于其形成的孢子不同故其菌落常呈現(xiàn)肉眼可見的不同結(jié)構(gòu)和色澤特征。商業(yè)無菌概念：罐頭食品經(jīng)過適度的殺菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物。這種狀態(tài)叫做商業(yè)無菌。保溫：低酸性罐頭食品——36±℃，10天酸性罐頭食品——30±1℃，10天預(yù)定輸往熱帶地區(qū)的低酸性食品——55±1℃，5~7天每日檢查是否胖聽、泄露

開罐

留樣pH測定感官檢查涂片染色接種GB4789.3-2010大腸菌群測定定義：Coliforms，一群在36℃培養(yǎng)48h可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源自人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義作為糞便污染食品的指標(biāo)菌，MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量產(chǎn)氣克雷白氏菌ETEC

EIEC

陰溝腸桿菌EHEC

大腸菌群耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）大腸桿菌產(chǎn)氣克雷白氏菌大腸埃希氏菌檸檬酸桿菌O157：H7大腸桿菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時(shí)，可引起感染。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。一般認(rèn)為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。

總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時(shí)能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。耐熱大腸菌群即糞大腸菌群，作為一種衛(wèi)生指標(biāo)菌，耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物，因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。但是，耐熱大腸菌群的存在并不代表對人有什么直接的危害。致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細(xì)胞，具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)腸出血性大腸桿菌，感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系第一法MPN法初發(fā)酵：月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯（LST）替代了乳糖膽鹽發(fā)酵培基確證實(shí)驗(yàn)：煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）替代了乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基，取消了革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間：由24h延長至48h單位：由MPN/100g變?yōu)镸PN/g取樣量：由3.33g0.333g大腸菌群計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程0將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST不產(chǎn)氣（-）

小導(dǎo)管里無氣泡

LST產(chǎn)氣（+）如何報(bào)告結(jié)果？根據(jù)經(jīng)確證后的對應(yīng)濃度陽性管數(shù)查MPN表MPN：最可能數(shù)，基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法陽性管數(shù)MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-理想與現(xiàn)實(shí)的差距新的方法更加嚴(yán)謹(jǐn)、合理、科學(xué)，與世界接軌然而老的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)仍然沿用MPN/100g（mL）0.3MPN/g=30MPN/100g？如何換算？30MPN/100g0.3MPN/g加樣量相應(yīng)擴(kuò)大10倍1g，0.1g，0.01g符合原方法的取樣量

查表，結(jié)果相應(yīng)縮小10倍統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不一定成立，只是過度臨時(shí)采用

仍然報(bào)告為0.3MPN/g，但要通知相關(guān)人員原因第二法VRBA平板計(jì)數(shù)法選擇15~150平板計(jì)數(shù)典型和可疑菌落36℃±1℃18h~24h挑選10個(gè)菌落接種到BGLB典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)，0.5mm致病菌的食品衛(wèi)生學(xué)意義食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定任何食品中不得檢出致病菌致病菌對人體健康的威脅是直接的和肯定的根據(jù)不同食品被污染的特點(diǎn)重點(diǎn)檢驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌如蛋禽肉主檢沙門氏菌，罐頭檢肉毒梭菌等微生物毒素也是重點(diǎn)，如金葡的腸毒素、黃曲霉毒素等微生物與食物中毒概念：指攝入了含有生物性、化學(xué)性有害物質(zhì)的食品或把有毒有害物質(zhì)當(dāng)作食品攝入后出現(xiàn)得非傳染性的急性、亞急性疾病。特點(diǎn)：潛伏期短，來勢急劇，短時(shí)多人同時(shí)發(fā)??；臨床表現(xiàn)大致相同；與吃某種有毒食品有關(guān)；發(fā)病率高，人與人之間并不傳染。分類：微生物性（細(xì)菌性、真菌性），化學(xué)性，動(dòng)、植物性，以細(xì)菌性最常見。細(xì)菌性食物中毒概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起的以急性腸胃炎為主的疾病。分類：感染型、毒素型、不定型病原菌常見食品潛伏期病程癥狀沙門氏菌肉乳蛋6~8h3~7d惡心嘔吐腹痛發(fā)熱冷汗頭痛副溶血性弧菌水產(chǎn)品腌制品8~24h1~3d惡心嘔吐腹痛腹瀉蠟樣芽孢桿菌米飯肉乳淀粉類30~60min1d惡心嘔吐腹痛腹瀉志賀氏菌簡介志賀氏菌屬為埃希氏桿菌，包括痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌四群，是引起人類細(xì)菌性痢疾的病原菌。它們主要通過食品加工、集體食堂和飲食行業(yè)的從業(yè)人員中痢疾患者或帶菌者污染食物，從而導(dǎo)致痢疾的發(fā)生，是一種較常見的、危害較大的致病菌。志賀氏菌的鑒定主要根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)，再以生化反應(yīng)證實(shí)。志賀氏菌檢驗(yàn)流程志賀氏菌屬生化特性試驗(yàn)挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和半固體瓊脂各一管。志賀氏菌在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果為底層產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可微產(chǎn)氣)，斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)生硫化氫，無動(dòng)力，在半固體管內(nèi)沿穿剌線生長。然后再做V-P/苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、西蒙氏檸檬酸鹽和葡萄糖銨試驗(yàn)，結(jié)果均應(yīng)陰性反應(yīng)。葡萄糖半固體

（無動(dòng)力）GB/T4789.10/38－2010金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)致病性：金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，因而食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問題，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道?？赏ㄟ^以下途徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷售人員；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過程受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí)，對肉體其他部位的污染。檢測流程計(jì)數(shù)及血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)接種BHI肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面溶血性鏈球菌形態(tài)與染色：球形或橢圓形鏈狀排列，無芽胞無鞭毛，革蘭陽性培養(yǎng)特征：營養(yǎng)要求較高，普通培基生長不良。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊、細(xì)小菌落。致病性：分布較廣存在，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會(huì)對人類進(jìn)行感染。常通過以下途徑污染食品：食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時(shí)造成食品的污染；食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r(shí)，其奶和肉尸某些部位污染；熟食制品因包裝不善而使食品受到污染?？梢鹌つw、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感染、流行性咽炎的爆發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱和風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等變態(tài)反應(yīng)。蠟樣芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌是一種地方性，土壤生活的，革蘭氏陽性β溶血性的桿狀細(xì)菌，它會(huì)引起食物中毒，例如“炒飯綜合癥”，會(huì)產(chǎn)生防御性的內(nèi)芽孢。由于錯(cuò)誤地烹調(diào)方法造成孢子殘留在食物上，更嚴(yán)重的是不當(dāng)冷凍而讓孢子發(fā)芽。細(xì)菌繁殖產(chǎn)生腸毒素，人食用后會(huì)產(chǎn)生嘔吐、腹瀉等不良癥狀。潛伏期8–16h。吃了冷藏不當(dāng)而變質(zhì)的剩飯是造成嘔吐病癥的最主要的原因。食用變質(zhì)食物后1–5小時(shí)就會(huì)引起惡心、嘔吐。這種病癥與其他的變質(zhì)引起的短期病癥（如金黃色葡萄球菌所造成的）較難辨別。副溶血性弧菌檢驗(yàn)弧菌科細(xì)菌的特點(diǎn)：1.革蘭氏陰性桿菌或彎曲狀的桿菌。2.端鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。3.不形成內(nèi)生孢子或小孢囊。4.有機(jī)化營養(yǎng)與兼性厭氧菌。5.無脫氮作用。6.大部分菌株為氧化酶陽性。7.可利用D-葡萄糖作為碳源和能源.8.大部分菌株可利用氨鹽作為氮源。9.大多數(shù)需要2-3%氯化鈉或海水為生長條件。10.水內(nèi)寄生菌，可在淡水、海水或水生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。11.某些種別對人、魚、鰻和青蛙等有致病性。12.DNA中G+C含量為38~63mol%副溶血性弧菌生長特性在TCBS平板上分解蔗糖產(chǎn)酸的菌落為黃色。副溶血性弧菌等不分解蔗糖為藍(lán)綠色菌落。TSI-NaCl副溶血弧菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，所以底部為黃色，不產(chǎn)硫化氫，而分解蛋白胨產(chǎn)生的堿使斜面變紅。阪崎腸桿菌阪崎腸桿菌屬于腸桿菌科、腸桿菌屬，是在人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌，是腸道正常菌叢的一種，具有機(jī)會(huì)致病性。能引起新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，并可引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和死亡，死亡率高達(dá)50%以上。目前，雖然還不能確定阪崎腸桿菌的宿主和傳播途徑，但多起新生兒阪崎腸桿菌感染事件表明了嬰兒配方奶粉是目前發(fā)現(xiàn)的主要感染源。繼美國FDA2002年在本土某些國際乳業(yè)巨頭生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中檢出該菌后，2003年又一家國際乳業(yè)巨頭主動(dòng)召回一批檢出極微量阪崎腸桿菌的奶粉，此后成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)。我國在2005年5月通過《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的審定，對奶粉嚴(yán)查此菌。

阪崎腸桿菌檢驗(yàn)流程10ml+mlST-Vm90ml或10ml+EE肉湯90ml36℃±1℃，24h±2h檢樣100g（ml）+BPW稀釋液900ml36℃±