《規(guī)?；馀?chǎng)牛冠狀病毒病診斷與防治技 術(shù)規(guī)程》

ICS01.040.65

CCSB04TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIA×××-××××

規(guī)模化肉牛場(chǎng)牛冠狀病毒病診斷與防治技

術(shù)規(guī)程

Technicalregulationsfordiagnosis,preventionandtreatmentof

Bovinecoronavirusdiseaseinlarge-scalebeefcattlefarms

(征求意見(jiàn)稿)

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施

寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)發(fā)布

發(fā)布

規(guī)?；馀?chǎng)牛冠狀病毒病診斷與防治技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了規(guī)?；馀?chǎng)牛冠狀病毒病診斷與防治技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、診斷、預(yù)防和治療。

本文件適用于規(guī)模肉牛場(chǎng)牛冠狀病毒病的防治。其他肉牛場(chǎng)參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

DB15/T2194-2021牛冠狀病毒PCR檢測(cè)方法。

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1牛冠狀病毒病Bovinecoronavirus

是指由牛冠狀病毒引發(fā)犢牛以出血性腹瀉為主要癥狀的傳染病。

4診斷

4.1流行病學(xué)

牛冠狀病毒多發(fā)于7～10日齡的犢牛。病牛和帶毒牛是感染性腹瀉的主要傳染源。通過(guò)消化道、呼

吸道、接觸、胎盤(pán)和交配等途徑傳播。本病一年四季均可發(fā)生，尤以氣候多變、寒冷季節(jié)和環(huán)境衛(wèi)

生較差時(shí)多發(fā)。

4.2臨床癥狀

犢牛感染后發(fā)生腹瀉，發(fā)病初期出現(xiàn)帶血的黃色黏性糞便，后期發(fā)展為水瀉，有時(shí)出現(xiàn)脫水、虛弱、

體溫低，少數(shù)犢牛出現(xiàn)發(fā)熱、臥地不起等癥狀，嚴(yán)重的犢牛會(huì)出現(xiàn)昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴

發(fā)，排出深褐色帶血稀糞，伴有產(chǎn)奶下降、沉郁及厭食等癥狀。

4.3病理變化

小腸腸壁變薄、透明，腸腔液體增多，嚴(yán)重者引起腹腔積水，胃內(nèi)有未消化的凝乳塊。感染的?？?/p>

2

能伴隨呼吸道癥狀，表現(xiàn)為氣管黏膜充血、局限性肺炎等。

4.4結(jié)果判斷

出現(xiàn)4.1、4.2、4.3，可判定為牛冠狀病毒病疑似病例。

5實(shí)驗(yàn)室診斷

5.1主要儀器設(shè)備

電鏡、低溫高速離心機(jī)、倒置顯微鏡、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀。

5.2主要試劑

PBS、2%磷鎢酸、胰酶、HCT-8細(xì)胞、PCRTaq酶。

5.3樣品采集

5.3.1糞便樣品

將棉拭子伸入肛門(mén)內(nèi)刮取新鮮糞便，放入裝有3mLPBS采樣管中；也可無(wú)菌采集地上剛排出新鮮

糞便。編號(hào)并記錄相關(guān)信息。

5.3.2組織樣品

取病死牛腸道及內(nèi)容物、肝、脾、淋巴結(jié)等，置于無(wú)菌密封袋或采樣杯內(nèi)。

5.4樣品處理

對(duì)于糞便樣品，放入盛有3mLPBS管中，充分振蕩，12000r/min4℃離心5min～8min，取上

清備用；對(duì)于組織樣品，稱(chēng)取1g置于研缽，充分研磨后加5mLPBS，混勻，8000r/min4℃離

心5min，取上清備用。將上清于0.22μm濾器過(guò)濾，-80℃冰箱保存或直接接種細(xì)胞。

5.5病原檢測(cè)

5.5.1病原檢測(cè)

5.5.1.1電鏡檢查

將采集的糞便或腸內(nèi)容物用PBS制成1:4懸液，于盛有玻璃珠的管內(nèi)充分震蕩30min，取懸液3000

r/min離心30min，取上清，15000r/min離心30min，取上清，以40000r/min～50000r/min離心3

h～5h，棄上清，加1～2滴蒸餾水懸浮管內(nèi)沉淀，滴加銅網(wǎng)，2%磷鎢酸染色，電鏡下觀察病毒粒

子形態(tài)。

5.5.1.2病毒分離鑒定

將處理的樣品接種HCT-8細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，根據(jù)中和試驗(yàn)（固定血清-稀釋病毒法）進(jìn)行病

毒鑒定。

5.6分子檢測(cè)

5.5.1基因組RNA提取

將5.4中樣品上清或5.5.1.2中純培養(yǎng)細(xì)胞毒用商品化試劑盒進(jìn)行基因組RNA提取。提取方法

按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

5.5.2反轉(zhuǎn)錄

將5.5.2中的基因組RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（見(jiàn)附錄表A,B）。

5.5.3基礎(chǔ)RPA鑒定

應(yīng)用基礎(chǔ)RPA方法進(jìn)行病原核酸檢測(cè)，BRV引物序列（見(jiàn)附錄表C）。

每次進(jìn)行RPA擴(kuò)增時(shí)，除檢測(cè)樣品外，均需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

RPA反應(yīng)體系（見(jiàn)附錄表D），反應(yīng)條件為37℃20min。

5.5.4RPA產(chǎn)物電泳

用1×TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠。取5μL產(chǎn)物分別加入樣品孔，同時(shí)在一加樣孔

中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL500），以5V/cm恒壓電泳，30min后采用凝膠成像系統(tǒng)判定核酸片

段大小。

5.5.5RPA結(jié)果判定

5.5.5.1陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條144bp大小的條帶，且陰性對(duì)照不出現(xiàn)條帶。

5.5.5.2在滿(mǎn)足5.5.5.1的條件下，被檢樣品的RPA產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條144bp的條帶判定

為核酸陽(yáng)性（＋）；被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后不出現(xiàn)144bp的條帶判定為核酸陰性（－）

（參見(jiàn)附錄B中圖A）。

5.7綜合判定

5.7.1確診

符合5.5.1.1、5.5.1.2、5.6，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷任一檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性可判定為牛冠狀病毒病。

4

6預(yù)防

6.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持衛(wèi)生清潔。按照GB/T16568和NY/T5049的規(guī)定。

6.2加強(qiáng)產(chǎn)房消毒衛(wèi)生，產(chǎn)房需要保暖、寬敞、通風(fēng)、干燥，產(chǎn)犢過(guò)程中排出物及時(shí)清除，隨時(shí)消

毒。6.3在保證舍內(nèi)溫度的前提下，自然通風(fēng)，保證牛舍干燥、舒適、溫暖。

6.4避免應(yīng)激，消除可能降低機(jī)體抵抗力的各種應(yīng)激因素。

6.5自然哺乳母牛定期消毒乳頭，防止致病微生物傳染犢牛。

6.6分娩時(shí)，落地犢?？诒乔形鸾佑|臟污。

6.7初生犢牛及時(shí)哺喂初乳。犢牛出生后1h內(nèi)灌服經(jīng)巴氏消毒的初乳4L，奶溫36℃～38℃，

12h后視情況可再飼喂2L。

6.8哺乳犢牛給予開(kāi)食料，補(bǔ)充微量元素，飼料配比適當(dāng)。

6.9牛群防疫參照NY5047的規(guī)定。

6.10可注射牛冠狀病毒疫苗，隨著國(guó)內(nèi)疫苗種類(lèi)的豐富，及時(shí)調(diào)整免疫程序。

6.11病死或死因不明牛按照《病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范》及《病死畜禽和病害畜禽產(chǎn)品

無(wú)害化處理管理辦法》的規(guī)定處理。

7治療

7.1獸藥使用應(yīng)符合NY/T5030的規(guī)定。

7.2針對(duì)冠狀病毒引起的腹瀉，及時(shí)隔離,防止繼發(fā)感染;針對(duì)酸中毒,靜脈注射5%碳酸氫鈉注射液，

每次100mL～200ml，或1.9%乳酸鈉溶液500mL～1000mL。

7.3對(duì)持續(xù)腹瀉不止的犢牛，可應(yīng)用明礬、次硝酸鉍、硅酸銀、顛茄酊(或流浸膏),內(nèi)服。

7.4及時(shí)補(bǔ)充體液，若脫水僅占體重8%以下時(shí)，給予口服補(bǔ)液;若脫水占體重8%以上或腹瀉嚴(yán)重時(shí)，

應(yīng)在給予[服補(bǔ)液的同時(shí)，皮下或靜脈注射含有碳酸鈉的林格氏液。

7.5制止腸內(nèi)腐敗、發(fā)酵過(guò)程，除應(yīng)用抗生素和磺胺類(lèi)藥外，也可適當(dāng)選用乳酸、克遼林等防腐制

酵藥物。

附錄A

表A反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

試劑使用量

RNase-freeddH2O10μL

5×All-in-oneQrtsUPERMix4μL

EnzymeMix1μL

模板RNA5μL

表B反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序

溫度時(shí)間

50℃15min

85℃5sec

表C輪狀病毒基礎(chǔ)RPA引物序列信息

引物名稱(chēng)引物序列（5'→3'）片段大小（bp）參考序列

BCoV-FGCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGA

144KT318094.

BCoV-RTCCGTCAATGTCGGTGCCATACTGGTCTTT

表DRPA反應(yīng)體系

試劑體積μL

BRV-F1（10μM）1.2μL

BRV-R1（10μM）1.2μL

Rehydrationbuffer14.75μL

模板1