《規(guī)?；驁?chǎng)致病性大腸桿菌病診斷與 防治技術(shù)規(guī)程》

ICS01.040.65

CCSB04TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIA×××-××××

規(guī)?；驁?chǎng)致病性大腸桿菌病診斷與

防治技術(shù)規(guī)程

Technicalregulationsfordiagnosis,preventionandtreatmentof

pathogenicEscherichiacolidiseaseinlarge-scalesheepfarms

(征求意見(jiàn)稿)

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施

寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)發(fā)布

發(fā)布

規(guī)?；驁?chǎng)致病性大腸桿菌病診斷與防治技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了規(guī)?；驁?chǎng)致病性大腸桿菌病診斷與防治技術(shù)規(guī)程的術(shù)語(yǔ)和定義、診斷、預(yù)防和

治療。

本文件適用于規(guī)?；驁?chǎng)致病性大腸桿菌病的防治。其他羊場(chǎng)參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB4789.6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)

GB4789.38食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)

GB4789.41食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)c桿菌科檢驗(yàn)

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

SN/T2025動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室生物安全操作規(guī)范

SN/T2984檢驗(yàn)檢疫動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)生物安全要求細(xì)則

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1致病性大腸桿菌extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，EPEC

是一組不同種類(lèi)的不僅可正常定殖于畜禽等腸道，而且能侵入血液循環(huán)系統(tǒng)引起菌血癥，并誘

發(fā)敗血癥或局部腸道外感染的大腸桿菌。

3.2伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基eosin-methyleneblueagar，EMBagar

即大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基，主要用于大腸桿菌的分離和培養(yǎng)。

3.3血平板培養(yǎng)基Bloodplateculturemedium

主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)。

3.4產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒別培養(yǎng)基IdentificationmediumforClostridiumperfringens

主要用于分離大腸桿菌和梭菌。

4診斷

4.1流行病學(xué)

羊致病性大腸桿菌病主要感染10日齡內(nèi)的羔羊。圈舍衛(wèi)生狀況、氣候變化等應(yīng)激因素可誘發(fā)

羊大腸桿菌病的發(fā)生。

4.2臨床癥狀

下痢型：多發(fā)生于7日齡以?xún)?nèi)的羔羊。病初體溫略高（40.5～41℃），糞便呈半液狀，帶有氣泡，

具有惡臭，起初呈淡黃色，繼之變?yōu)榈野咨?，含有乳凝塊，嚴(yán)重時(shí)混有血液，不及時(shí)治療于24～

36h死亡。

敗血性：多發(fā)生于2～6周齡羔羊。病羊體溫41～42℃，精神沉郁，迅速虛脫，有輕微的腹瀉或

不腹瀉，有的帶有神經(jīng)癥狀，也有的病例出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，多于病后4～12h死亡。

4.3病理變化

下痢型：剖檢尸體嚴(yán)重脫水，真胃、小腸和大腸內(nèi)容物呈黃灰色半液狀，黏膜充血，腸系膜淋

巴結(jié)腫脹發(fā)紅。

敗血性：剖檢病變可見(jiàn)胸、腹腔和心包大量積液，內(nèi)有纖維素；某些關(guān)節(jié)，尤其是肘和腕關(guān)節(jié)

腫大，滑液渾濁，內(nèi)含纖維素型膿性絮片。

4.4樣本采集

采集：無(wú)菌操作采集肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、腦等腸外組織，或關(guān)節(jié)積液、心包積液。

保存與運(yùn)輸：病料樣品采集后不能及時(shí)送檢的，可保存于飽和氯化鈉溶液或30%甘油緩沖鹽水

溶液中，保存時(shí)間不超過(guò)72h。樣品均需采取低溫（0℃～4℃）保存和運(yùn)輸。

4.5分離培養(yǎng)

伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基配制見(jiàn)附錄A.1，血平板培養(yǎng)基配制見(jiàn)附錄A.2，產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒別培養(yǎng)基

配制見(jiàn)附錄A.3。

將無(wú)菌采集的羔羊臟器組織、腸組織和腸系膜淋巴結(jié)的表面進(jìn)行火焰滅菌，剪取一定量的深部

組織，在無(wú)菌操作條件下接種至伊紅美藍(lán)瓊脂、血平板和產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒別培養(yǎng)基中，每份病料樣

品各接種2份。平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h后，可觀察到伊紅美藍(lán)瓊脂上形成有金屬光

澤的黑色單一菌落，見(jiàn)附錄B.1（1）；血平板上有中等大小、具有溶血圓的灰色圓形單一菌落，見(jiàn)

附錄B.1（2）；產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒別培養(yǎng)基中無(wú)菌落生長(zhǎng)。

2

4.6顯微鏡觀察

挑取伊紅美藍(lán)平板和血平板上的單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)兩端鈍圓的

紅色革蘭氏陰性短桿菌,見(jiàn)附錄B.2。

4.7同源性比較與遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)GenBank中登錄的大腸桿菌基因全序列，合成細(xì)菌16SrRNA通用引物，見(jiàn)附錄A.4，PCR片

段大?。?465bp），見(jiàn)附錄B.3。

4.8腸外大腸桿菌致病性鑒定

取10只健康狀態(tài)良好小鼠，分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。將4.6中鑒定均符合的大腸桿菌分

離株制成濃度約為0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙?，分別腹腔注射試驗(yàn)組小鼠，每只0.3mL。對(duì)照組小鼠每

只腹腔注射0.3mL用于稀釋菌液的無(wú)菌生理鹽水。注射后觀察3d內(nèi)小鼠精神狀況及死亡情況。若

對(duì)照組小鼠均健活，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)精神萎靡，不進(jìn)食，靜止抱團(tuán)不活動(dòng)，最后死亡的臨床癥狀，

并將死亡的小鼠在無(wú)菌操作下取其肺臟、肝臟、脾臟組織分別接種于EMB，37℃培養(yǎng)24h，挑取大

腸桿菌疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果與接種菌株一致則說(shuō)明待檢大腸桿菌分離株為EPEC。

4.9結(jié)果判定

符合4.1、4.2和4.3的特征判斷為疑似病例。

同時(shí)符合4.4、4.5、4.6、4.7或4.8的特征判斷為確診病例。

4.10預(yù)防和治療

4.10.1預(yù)防

妊娠母羊飼養(yǎng)管理：妊娠階段合理配制日糧，應(yīng)富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及維生素，滿足妊娠母

羊營(yíng)養(yǎng)需求，保持良好膘情，促進(jìn)胎兒發(fā)育，同時(shí)提升初乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

重視接產(chǎn)管理：接產(chǎn)前做好產(chǎn)房消毒工作，建議使用3%來(lái)蘇兒溶液噴霧消毒，營(yíng)造無(wú)菌的生產(chǎn)

環(huán)境。

加強(qiáng)初生羔羊飼養(yǎng)管理：羔羊出生后2h內(nèi)應(yīng)吃上、吃足初乳，以獲得充足的免疫抗體。母乳不

足時(shí)及時(shí)人工輔助喂養(yǎng)，避免因吃乳不足導(dǎo)致羔羊體質(zhì)降低。哺乳前清洗母羊乳頭，用0.1%高錳酸

鉀消毒，防止羔羊吃乳時(shí)感染。

4.10.2治療

配合藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行抗生素治療，使用劑量參照說(shuō)明書(shū)。

4

附錄A

（規(guī)范性附錄）

大腸桿菌培養(yǎng)基配制

A.1伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，磷酸氫二鉀2.0g，瓊脂15.0g，伊紅0.4g，美藍(lán)0.065g，溶于1000mL

蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，傾入無(wú)菌平皿，4℃保存。

A.2血平板培養(yǎng)基

血平板培養(yǎng)基：牛心浸粉15.0g，氯化鈉5.0g，豌豆浸粉3.0g，瓊脂15.0g溶于1000mL蒸餾水

中，121℃高壓滅菌15min，冷卻至50-55℃時(shí)無(wú)菌操作加入10%無(wú)菌脫纖維羊血，混勻，傾入無(wú)菌平

皿，4℃保存。

A.3產(chǎn)氣莢膜梭菌顯色培養(yǎng)基

瓊脂15.0g，蛋白胨和酵母粉25.0g，鹽類(lèi)6.0g，色素1.4g，生長(zhǎng)因子3.5g溶于1000mL蒸餾水

中，121℃高壓15min，冷卻至45~50℃加入增補(bǔ)劑S120mL和增補(bǔ)劑S21mL，輕輕搖晃均勻，傾入

平皿，凝固，4℃保存。

A.4細(xì)菌16SrRNA通用引物

擴(kuò)增E.coli16SrRNA基因片段的引物序列信息

引物名稱(chēng)引物序列（5′-3′）片段大?。╞p）

PrimernamePrimersequence(5′-3′)Productlength

27F5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

1465

1492R5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′