(高清版)DB22∕T 2051-2014 飼料中肉毒梭菌測定 PCR 方法　　

2014-02-28發(fā)布2014-04-30實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、國家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中華人民共和國吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國順德出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷宇、劉金華、邵秋榮、劉斌、周亮、劉曉暉、王瀟、任明月。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3術(shù)語和定義5.1引物：見表1。2表1引物序列目標(biāo)菌類型引物序列上游引物：5'-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’下游引物：5'-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’上游引物：5'-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3'下游引物：5'-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3'上游引物：5'-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3'下游引物：5'-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3'上游引物：5'-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3'下游引物：5'-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3'5.2皰肉培養(yǎng)基：見附錄A.1章。5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY):見附錄A.2章。5.4厭氧卵黃瓊脂：見附錄A.3章。5.5細(xì)菌基因組DNA提取純化試劑盒。5.7dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosp脫氧鳥苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脫氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸)。5.9蛋白酶K。5.11十二烷基硫酸鈉(SDS)。5.12蔗糖。5.13三羥甲基氨基甲烷(Tris)。5.14乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na?·2H?O)。5.1510×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化鉀(KC1),15mmol/L氯化鎂(MgCl?)。5.19EDTA溶液，0.5mol/L,pH8.0:稱取186.1gEDTA-Na?·2H?O,加入700mL去離子水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0,用水定容到1L,分裝后高壓滅菌。5.20Tris-HCl,1mol/L,pH8.0:在800mL溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。5.21TE緩沖液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCI(pH8.0)和2mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0),用水定容到1L,分裝后高壓滅菌。5.22溶菌酶溶液：用TE配制，使用濃度為10mg/mL。5.2420%SDS溶液：將20gSDS溶解在100mL去離子水中。3DB22/T2051—20145.2550×TAE電泳緩沖液(儲(chǔ)備液):稱取484gTris,量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0),溶于水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用前稀釋成1×TAE電泳緩沖液(工作液)。用10mL水溶解；稱取蔗糖50g,用30mL水溶解，合并三種溶液，用水定容至100mL,在4℃保存。5.27陽性對(duì)照：含有擴(kuò)增片段的質(zhì)?；駻、B、E、6.3恒溫培養(yǎng)箱：35℃±1℃和28℃±1℃。6.11天平：感量0.1g。7檢測培養(yǎng)基中的氧，并迅速冷卻，切勿搖動(dòng)。每15mL增菌肉湯中接種1g~2g樣品，接種時(shí)將接種物慢慢接入肉湯液面以下。每份樣品接種兩管皰肉培養(yǎng)基，置35℃±1℃,同時(shí)接種兩管TPGY培養(yǎng)基，置28℃±1℃,厭氧培養(yǎng)5d。檢查培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉粒的消化和產(chǎn)生的氣味。若有生長，按7.2分用接種環(huán)取1環(huán)～2環(huán)經(jīng)乙醇或加熱處理的培養(yǎng)物在厭氧卵黃瓊脂上劃線接種，置厭氧條件下35℃±1℃培養(yǎng)48h。47.3DNA提取7.4DNA濃度測定…7.5PCR檢驗(yàn)7.5.1PCR反應(yīng)體系7.5.2反應(yīng)條件7.5.3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測8結(jié)果判定511.1檢驗(yàn)過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。6A.1皰肉培養(yǎng)基a)新鮮牛肉500.0gb)蛋白胨30.0gc)酵母浸膏5.0ge)葡萄糖3.0gA.1.2制法a)胰酪胨(trypticase)b)蛋白胨c)酵母浸膏d)葡萄糖e)硫乙醇酸納7a)酵母浸膏50.0gc)蛋白胨20.0g分混合，存于4℃?zhèn)溆谩.3.3制法每500mL瓊脂基礎(chǔ)液(48℃~50℃)加80mL卵黃乳狀液，充分混合，制成平板。室溫放置2d,8B.1試劑B.1.1明膠磷酸鹽緩沖液：明膠2g,磷酸氫二鈉4g,蒸餾水1000mL。將上述成分加熱溶解，調(diào)pH至6.2,121℃高壓滅菌15