液相色譜儀器(共52張)

液相色譜儀器（一）色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分色譜知識(shí)色譜法(Chromatography)：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)流動(dòng)相：攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動(dòng)的一相液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析

液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)

色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器貯液瓶（流動(dòng)相）數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)島津LC2010高效液相色譜儀島津LC2010高效液相色譜儀一.貯液瓶(流動(dòng)相)流動(dòng)相的作用:1.攜帶樣品

2.分離樣品

采用“HPLC”

級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配流動(dòng)相的選擇應(yīng)注意溶劑等級(jí)水的等級(jí)純化水蒸餾水去離子水波長(zhǎng)(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子水的吸光率較高純化水中去除了無(wú)機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率溶劑等級(jí)溶劑的等級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過(guò)蒸餾和0.45u的過(guò)濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過(guò)0.2u的過(guò)濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫流動(dòng)相的前處理

1.

過(guò)濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其在使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí)過(guò)濾膜種類:1.水系過(guò)濾膜2.有機(jī)系過(guò)濾膜3.混合系流動(dòng)相的前處理

2.脫氣(用超聲波)

目的：除去流動(dòng)相中因溶解或混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡產(chǎn)生原因：溫度上升、壓力下降、溶劑混合3.貯存：應(yīng)貯存于玻璃容器中。不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。

液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器貯液瓶（流動(dòng)相）數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)二.輸液泵作用:高壓輸送流動(dòng)相.種類：恒壓泵恒流泵恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為：

1.螺旋注射泵

2.柱塞往復(fù)泵

3.隔膜往復(fù)泵輸液泵－柱塞往復(fù)泵單向閥馬達(dá)和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭10-100uL泵的維護(hù)1.防止固體微粒進(jìn)入泵體。(流動(dòng)相嚴(yán)格過(guò)濾)2.防腐蝕.(流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì))3.防空泵運(yùn)轉(zhuǎn).(泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液)4.防壓力過(guò)高.(輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。)5.防氣泡.流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無(wú)法正常工作。

液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器貯液瓶（流動(dòng)相）數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)三.進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器

自動(dòng)進(jìn)樣的特點(diǎn)：1、超高的進(jìn)樣精度2、超快的進(jìn)樣速度3、可以進(jìn)行批進(jìn)樣計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)的作用：Peaks1.流動(dòng)相：攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法應(yīng)貯存于玻璃容器中。填料粒度:一般為3,5,7,10μm2.2）可用于梯度分析2）柱溫在40℃左右,一般不超過(guò)50℃HPLC的檢測(cè)器要求：液相色譜的分離原理是什么？因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子水的吸光率較高液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器貯液瓶（流動(dòng)相）數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)四.色譜柱作用:分離樣品

分離原理:1.液固色譜法

2.液液色譜法

(正相和反相)3.離子交換色譜法4.離子對(duì)色譜法5.排阻色譜法四.色譜柱填料:多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹(shù)脂）、多孔碳等填料粒度:一般為3,5,7,10μm

內(nèi)徑:2-5mm（常用4.6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm）柱長(zhǎng):10-30cm四.色譜柱柱的發(fā)展方向：更短,柱長(zhǎng)3-10cm

填料顆粒更小,粒徑2-3μm色譜柱的使用注意點(diǎn)1）避免柱壓過(guò)高（根據(jù)不同的柱子要求不同）2）柱溫在40℃左右,一般不超過(guò)50℃3）一般ODS柱流動(dòng)相PH使用范圍為2～7.54)流動(dòng)相有機(jī)溶劑比例過(guò)低,柱效下降快5）避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。6）應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。色譜柱的使用注意點(diǎn)7）樣品進(jìn)樣前必須經(jīng)過(guò)微孔膜過(guò)濾8）經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。如果用緩沖溶液作為流動(dòng)相，分析結(jié)束時(shí)必須先用純水沖洗10分鐘，再用甲醇-水沖洗，絕不能讓緩沖溶夜留在柱子中過(guò)夜。9）使用保護(hù)柱可延長(zhǎng)柱子壽命。保護(hù)柱應(yīng)經(jīng)常更換。

柱溫箱柱溫控制的優(yōu)點(diǎn)：1、控制溫度，保證分析結(jié)果重現(xiàn)性2、升高溫度，降低了流動(dòng)相的黏度，降低柱壓，保證色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器貯液瓶（流動(dòng)相）數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)五.檢測(cè)器檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分定量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC的檢測(cè)器要求：靈敏度高噪音低（對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）線性范圍寬重復(fù)性好適用范圍廣紫外可見(jiàn)檢測(cè)器（UV/VIS）二極管陣列檢測(cè)器（PDA）示差檢測(cè)器（RID）電導(dǎo)檢測(cè)器（CDD）熒光檢測(cè)器（RF）電化學(xué)檢測(cè)器（L-ECD）質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）常用檢測(cè)器紫外可見(jiàn)檢測(cè)器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收優(yōu)點(diǎn)：1）對(duì)溫度和流速變化不敏感2）可用于梯度分析缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì)紫外可見(jiàn)檢測(cè)器樣品池參比池光電管光電管EinEinEin光柵D2/W燈lEout紫外可見(jiàn)檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率變化以測(cè)定試樣各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器缺點(diǎn)：1）對(duì)溫度和壓力變化敏感2）不能用于梯度分析原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測(cè)器之一2）選擇性好3）對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)熒光檢測(cè)器液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)六.數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)的作用：①采集信號(hào)、分析數(shù)據(jù)；②控制色譜儀基本概念和術(shù)語(yǔ)

1、色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線。2、基線(baseline)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。3、漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移?；靖拍詈托g(shù)語(yǔ)4、色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分5、峰面積(peakarea，A)——峰與峰底所包圍的面積6、保留時(shí)間(retentiontime，tR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。數(shù)據(jù)處理1.定性：保留時(shí)間2.定量方法：內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法面積歸一法

糖的色譜圖AnalyticalConditionsColumn:Shim-packCLC-NH2Mobilephase:Acetonitrile/water=7/3Flowrate:1.0mL/minTemperature:AmbientPeaks

1.甘油

2.木糖

3.果糖

4.葡萄糖

5.蔗糖

6.甘露糖

7.乳糖

數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:※曲線點(diǎn)數(shù)：一點(diǎn)、兩點(diǎn)及多點(diǎn)※曲線計(jì)算：線性范圍、線性回歸、折線、二次曲線、三次曲線外標(biāo)法公式：優(yōu)點(diǎn)：1）不需所有峰都流出或被檢測(cè)到2）只對(duì)所測(cè)組分作校正缺點(diǎn)：1）進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確2）儀器必須有良好的穩(wěn)定性AiCiCi=Fi×Ai面積歸一化法

公式：優(yōu)點(diǎn)：1）無(wú)需做校正，簡(jiǎn)便，快速2）進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求缺點(diǎn)：1）所有組分都流出且被檢測(cè)到2）所有組分的檢測(cè)靈敏度都相同內(nèi)標(biāo)法公式：優(yōu)點(diǎn)：1）進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求2）只對(duì)所測(cè)組分作校正3）減少前處理影響缺點(diǎn)：1）必須在樣品中加一內(nèi)標(biāo)組分2）操作較為繁瑣3）選擇內(nèi)標(biāo)物困難Ai/AisCi/Cis液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)維生素B族含量的測(cè)定一、色譜條件：

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器色譜柱：ODS150mm×4.6mm粒度5.0μm

流動(dòng)相：甲醇-已烷磺酸鈉溶液30:70

波長(zhǎng)：280nm

流速：0.8ml/min

柱溫:30℃

維生素B族含量的測(cè)定二.所需主要儀器、試劑和耗材

1.儀器：島津LC2010AH液相色譜儀、真空泵、超聲波清洗機(jī)、抽濾裝置、離心機(jī)等

2.試劑：甲醇（色譜級(jí)）、超純水、己烷磺酸鈉、二乙胺、磷酸、維生素B1及B6標(biāo)準(zhǔn)品

3.耗材：0.45um有機(jī)系微孔濾膜、無(wú)機(jī)系針孔濾膜維生素B族含量的測(cè)定三、操作步驟：1.流動(dòng)相前處理：脫氣過(guò)濾2.打開(kāi)液相色譜儀及計(jì)算機(jī)，打開(kāi)液相色譜儀控制軟件3.設(shè)定所需的色譜條件，并下載到色譜儀，運(yùn)行，等待基線平衡（一般需要30min以上）維生素B族含量的測(cè)定4.樣品前處理：取樣→研磨→定容→超聲波振蕩提取

→過(guò)濾5.配制標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，用0.45um微孔膜過(guò)濾到樣品瓶中6.待基線平衡后，將標(biāo)準(zhǔn)品及樣品分別進(jìn)行進(jìn)樣分析6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm）純化水中去除了無(wú)機(jī)和有機(jī)的污染物色譜法(Chromatography)：利用組分在兩相試樣各組分濃度。2.2u的過(guò)濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)45um有