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文檔簡介

GXASDetectionofAnimal-originChlamydiaI本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1動物鸚鵡熱衣原體實時熒光PCR檢測方法本文件規(guī)定了動物鸚鵡熱衣原體實時熒光PCR檢測方法涉及的術(shù)語和定義、原理、試劑和材料、儀GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格MOMPmajoroutermembrane根據(jù)Cps基因特定序列的保守片段，合成一對特異性引物和一條特異性的熒探針兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團。當(dāng)PCR擴增時，探針被酶切降解，使熒光報2針對CpsMOMP基因保守序列設(shè)計引物和探針，預(yù)期擴增產(chǎn)物大小為145bp。引物和探針序列詳見附5.4質(zhì)粒提取試劑盒6.6冰箱：2℃~8℃和-20℃及以下用無菌棉拭子采集喉頭、泄殖腔、眼眶分泌物，浸入1使用真空管（含EDTA抗凝劑）采集動物全血2mL～5mL，密封后冷藏，并于24h內(nèi)送至實驗室立即取適量采集的組織樣品置于組織勻漿器中充分研磨，加入滅菌的0.1mol/LPBS（pH7.4）制備10%組織勻漿液。3000r/min離心10min。取上清液，做好標識，立即進行Cps核酸檢測或-20℃及以下儲39.1核酸提取9.2核酸擴增9.2.1擴增體系PremixExTaq(ProbeDNA模板9.2.2擴增條件），9.3.1陰性對照采用含有Cps特定基因保守序列的重組質(zhì)粒p-Cps作為陽性對照。重組質(zhì)粒標準品p-Cps制備方法與4FAM-TTACCTATAACGGCTGGAACAACA-B5采用人工合成的方法合成一段含有CpsMOMP基因特定保守靶序列，該靶序列包含本文件5.3中引物受態(tài)細胞，挑取重組子菌落經(jīng)PCR鑒定正確，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，測算濃度，即構(gòu)建成重組TCAAGCCCAGCACAATTTGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATAAAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTTACCTATAACGGCTGGAAGAAGCTACAGACACCAAATCAGCTACAATTAAATACCATGAATGGCAAGTAGGCCTCGCCCTGTCTTACAGATTGAATATGCTTGTTCCATATA

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