DB51T 1203-2011 馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程　

DB51/T1203—20112011-01-25發(fā)布2011-03-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 1 15試劑與材料 16儀器及用具 3 38實驗室檢驗 39結(jié)果判定 410樣品保存 4附錄A(資料性附錄)馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒基本信息 5附錄B(資料性附錄)馬鈴薯M病毒DAS-ELISA檢驗程序 6附錄C(資料性附錄)馬鈴薯S病毒DAS-ELISA檢驗程序 8附錄D(資料性附錄)馬鈴薯M病毒RT-PCR檢驗程序 附錄E(資料性附錄)馬鈴薯S病毒RT-PCR檢驗程序 本標準分為范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、原理、試劑與材料、儀器及用具、取樣、實驗室檢驗、結(jié)果判斷、樣品保存等部分。本標準由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標準起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站。本標準主要起草人：寧紅、萬佳、劉可、郭迪金、吳志平、黃玲、李耄11范圍本標準規(guī)定了馬鈴薯M病毒(見附錄A)、馬鈴薯S病毒(見附錄A)的取樣、實驗室檢驗、結(jié)果判斷2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569-2009農(nóng)業(yè)植物調(diào)運檢疫規(guī)程DB51/T868-2009馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯A病毒檢驗鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。3.1注：改寫DB51/T868-2009,定義3.6。4原理兩種病毒田間通過蚜蟲和農(nóng)事操作進行傳播，遠距離主要通過人為的引種、商品流通等途徑傳播，帶毒塊莖和種苗是該病毒遠距離傳播的主要載體，兩種病毒具有潛隱性，根據(jù)病害癥狀很難確定馬鈴薯M病毒和馬鈴薯S病毒的病毒種類，薯塊上一般不表現(xiàn)癥狀。5試劑與材料除非另有說明，在本標準中僅使用確認的分析純試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。5.1免疫學檢驗試劑5.1.1.1馬鈴薯M病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進行。貯藏于4℃條件下備用。25.1.1.2馬鈴薯S病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進行。貯藏于4℃條件下備用。5.1.2.1用堿性磷酸酶標記的馬鈴薯M病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進行稀釋，貯藏于4℃條件下備用。5.1.2.2用堿性磷酸酶標記的馬鈴薯S病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進行稀釋，貯藏于4℃條件下備用。5.1.3包被緩沖液(Coatingbuffer)取2.93g碳酸氫鈉(NaHCOs)水磷酸二氫鉀(KH?PO?)、8.0g氯化鈉(NaCl)、0.5g吐溫-20,用1000mL蒸餾水溶解，并調(diào)整pH值到7.4。24-4000)、0.2g疊氮化鈉(NaN?)、2.0gⅡ級雞蛋清白蛋白粉、20.0g吐溫-20,用1000mL洗滌液溶解，并調(diào)整pH值到7.4,貯藏于4℃條件下備用。5.1.6酶標抗體稀釋緩沖液(ECIBuffer)取0.2g牛血清白蛋白(或脫脂奶粉)、2.0g聚乙烯吡藏于4℃條件下備用。5.1.7底物緩沖液(PNPBuffer)用80mL滅菌值到9.8,定容到100mL,貯藏于4℃條件下物溶液制備需在孵育結(jié)束前15min內(nèi)，避光條件下制備。5.2.35×RT緩沖液(5xRTBuffer)50mMTis-HClPH7.5,100mMNaC1,0.1mMEDTA,10mMDTT,0.01%NP-40,50%甘油。5.2.410×PCR緩沖液100mMTr5.2.5MgCl?25mM。5.2.6RNA酶抑制劑(RNasin)10U/μ1。5.2.7RT增強劑(RTEhancer)。5.2.11Taq酶2.5U/μ1。5.2.14雙蒸水(ddH?O)。5.2.16液氮(N?)。35.2.17.1PVM上游引物(P1)堿基序列：5'-下游引物(P2)堿基序列：5'-用雙蒸水稀釋至20μM。下游引物(P2)堿基用雙蒸水稀釋至20μM。5.2.19溴酚藍(Bromophenolblue)C??H??Br?O?S。5.2.20瓊脂糖凝膠稱取1.5g瓊脂糖緩緩倒入250mL三角瓶內(nèi)，加入100mL1×TAE,在微波爐中小心拔出梳齒。儀器及用具包括：——聚乙烯微量滴定板根據(jù)樣品數(shù)量選用40孔和96孔兩種規(guī)格；規(guī)格及配套吸頭；——天平1/100g,1/1000g;——培養(yǎng)箱；——臺式高速離心機；——酶聯(lián)免疫檢測儀；——水平電泳儀；——凝膠成像系統(tǒng)；——PCR擴增儀；——EP管；——冰箱；——超低溫冰箱；——渦旋混勻器。取樣方法按DB51/T868-20097.2和DB51/T868-20097.3的規(guī)定。7.2種薯(塊莖)取樣按GB15569-20096.2的規(guī)定進行抽樣。48.1.1馬鈴薯M病毒檢驗方法見附錄B。如采用認可的試劑盒，按說明操作。8.1.2馬鈴薯S病毒檢驗方法見附錄C。如采用認可的試劑盒，按說明操作。8.2.1馬鈴薯M病毒樣品的制備與檢驗方法見附錄D。如采用認可的試劑盒，按說明操作。8.2.2馬鈴薯S病毒樣品的制備與檢驗方法見附錄E。如采用認可的試劑盒，按說明操作。9.1DAS-ELISA在陰性對照OD值≤0.1,且陽性對照OD值大于陰性對照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對照OD值2倍時，判定為陽性反應，即樣品帶相應的被檢病毒；否則判定為陰性反應，即樣品不帶相應的被檢病毒。在陰性對照無擴增條帶，且陽性對照出現(xiàn)630bp目標條帶的前提下，樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果在630bp處出現(xiàn)目標條帶，判定為陽性反應，即樣品帶PVM病毒；否則判定為陰性反應，即樣品不帶PVM病毒。在陰性對照無擴增條帶，且陽性對照出現(xiàn)435bp目標條帶的前提下，樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果在435bp處出現(xiàn)目標條帶，判定為陽性反應，即樣品帶PVS病毒；否則判定為陰性反應，即樣品不帶PVS病毒。10樣品保存經(jīng)檢疫鑒定后的樣品，應在-80℃~-20℃保存三個月，以備復驗、談判和仲裁，保存期滿后，需進行滅活處理。5(資料性附錄)馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒基本信息A.1.1馬鈴薯M病毒potatovirusM簡稱PVM。屬香石竹潛隱病毒屬。病毒粒體微曲線狀，大小650×12nm,致死溫度65～71℃,稀釋限點100～1000倍，20℃體外存活期幾天。引起馬鈴薯小葉病。A.1.2馬鈴薯S病毒potatovirusS病汁液稀釋限點1~10倍，鈍化溫度55~60℃,體外存活期3～4天。在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，其寄主范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植物A.2為害A.2.1馬鈴薯M病毒為害癥狀產(chǎn)生明顯花葉，葉片嚴重變形，并很快黃化至干枯；病株嚴重萎縮和矮化，其株高只相當于健株的1/3度在24℃以上，病癥隱蔽。該病毒是馬鈴薯上常見的病害，可引起較大的產(chǎn)量損失，在東歐引起的產(chǎn)量A.2.2馬鈴薯S病毒為害癥狀馬鈴薯S病毒單獨侵染時常常不表現(xiàn)癥狀，可持續(xù)存在馬鈴薯薯塊中，并通過薯塊作遠距離傳播。在田間該病毒傳播很快，傳播范圍廣，既可通過葉片接觸傳播，也可通過蚜蟲傳播，種植一季后感染率可高達70%,可使馬鈴薯減產(chǎn)10-20%。當與馬鈴薯X病毒混合侵染時，可減產(chǎn)20-30%。A.3傳播途徑兩種病毒田間通過蚜蟲和農(nóng)事操作進行傳播，遠距離傳播主要通過人為的引種、商品流通等，帶毒塊莖和種苗是該病毒傳播的主要載體。6DB51/T1203—2011(資料性附錄)馬鈴薯M病毒DAS-ELISA檢驗程序B.1包被抗體B.1.1包被B.1.2洗板吸干反應孔中殘留液體。B.2點樣B.2.1樣品制備將待測樣品剪碎，取0.3g于研缽中，加入1mL樣品提取液充分研磨后，再加入2mL樣品提取液充分研磨至均勻。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時應注意防止樣品的交叉污染。B.2.2點樣馬鈴薯健康組織研磨液陰性對照和包被緩沖液空白對照。加樣完成后將酶聯(lián)反應板置于保濕容器中，室B.2.3洗板在每個反應孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置3min后將洗滌液迅速倒出。重復3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應孔中殘留液體。B.3結(jié)合酶標抗體B.3.1加酶標抗體B.4顯色7DB51/T1203—2011B.5終止反應8(資料性附錄)C.1包被抗體C.1.1包被向酶聯(lián)反應板每孔加入100μL用包被緩沖液稀釋的PVS捕捉抗體，將酶聯(lián)反應板置于保濕容器中，室溫孵育4h或4℃冰箱過夜。C.1.2洗板向每個反應孔中加入200μL洗滌液，迅速倒出，重復2次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應孔中殘留液體。C.2.1樣品制備將待測樣品剪碎，取0.3g于研缽中，加入1mL樣品提取液充分研磨后，再加入2mL樣品提取液充分研磨至均勻。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時應注意防止樣品的交叉污染。C.2.2點樣用微量進樣器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應板孔內(nèi)，每個樣品三次重復，每孔100μL。設(shè)置陽性對照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對照和包被緩沖液空白對照。加樣完成后將酶聯(lián)反應板置于保濕容器中，室溫孵育2h或4℃冰箱12h。C.2.3洗板在每個反應孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置3min后將洗滌液迅速倒出。重復3次。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應孔中殘留液體。C.3結(jié)合酶標抗體C.3.1加酶標抗體向酶聯(lián)反應板每孔加入100μL用PVS酶標抗體稀釋緩沖液按比例稀釋的酶標抗體溶液。置于保濕容器中室溫孵育2h。C.4顯色每孔加入100μL底物溶液。25℃避光孵育30min～60min,至陽性對照顯色。9DB51/T1203—2011C.5終止反應DB51/T1203—2011(資料性附錄)馬鈴薯M病毒RT-PCR檢驗程序D.1PVM模板RNA的制備采用TIANGENRNAprepPlantKit試劑盒(給出該試劑盒信息是為了方便標準使用者，如果等效產(chǎn)品具有相同效果，則可使用這些等效產(chǎn)品)提取馬鈴薯卷葉病毒RNA。稱取50mg~100mg的馬鈴薯葉片或莖桿(薯塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽),在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至預冷的1.5mL的EP管中，加入500μL的RL裂解液(使用前按RL裂解液1mL加入2-巰基乙醇10μL),渦旋劇烈震蕩5min使其混的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。緩慢加入上清液0.5倍體積無水乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入CR吸附柱中，12000rpm離心1min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入700μL去蛋白液RW1,12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CR中加入500μL漂洗液RW,12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復漂洗一次。漂洗完后，將吸附柱在12000rpm離心2min,,去除殘余液體，并在室溫下放置片刻。將吸D.2RT-PCR擴增D.2.1反轉(zhuǎn)錄D.2.1.1反應體系RT反應體系見表D.1。表D.1馬鈴薯M病毒RT反應體系反應物模板RNAP2RNasinRTEhancer5×RTbufferMMLV無RNA酶的加入量(μL)41D.2.1.2程序反轉(zhuǎn)錄程序為：4