版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
4.流式細胞術的參考樣品流式細胞術的參考樣品4.流式細胞術的參考樣品一·參考標準樣品在FCM使用的意義參考標準樣品在FCM中使用,為了監(jiān)測儀器的液流·電子和各個光學系統(tǒng)的穩(wěn)定性,校正和調(diào)試儀器的CV值,最大限度的提高儀器的分辨能力.4.流式細胞術的參考樣品
1.調(diào)整儀器在高性能的狀態(tài)下工作。
2.由于FCM的測量是相對的,而不是絕對的,所以參考細胞有助于單個樣品或一組樣品的測量參數(shù)的解釋。
3.參考標準細胞可供監(jiān)測工作狀態(tài)下儀器的穩(wěn)定性,以使所測參數(shù)具有可靠性和可比性。
4·參考細胞可被用于監(jiān)測染色過程。
5·能夠用于校驗FCM分選術的回收和純度。參考細胞的主要作用如下:4.流式細胞術的參考樣品二、標準細胞樣品具備的特性一個標準樣品,應具有較恒定的體積大小具有較恒定熒光發(fā)射量子細胞的形狀較一致在液流中的流動取向較一致在懸液中可保持高度的單分散狀態(tài),放置較長時間不會聚集、不改變其形狀、體積大小及其光學特性4.流式細胞術的參考樣品1.外標法標準樣品在流式分析實驗樣品前或后,上儀器測量,以校正儀器在工作條件下穩(wěn)定性。缺點由于參考樣品與實驗樣品不同步染色,以及在實驗過程中儀器條件的漂移,可能引起定量檢測的誤差,因此,近年在流式細胞定量檢測中已被摒棄。參考標準的使用方法4.流式細胞術的參考樣品2.內(nèi)標法內(nèi)標法是將標準樣品與實驗樣品按一定的細胞數(shù)混懸在一起進行同步染色,這種方法可以避免外標法引入的誤差,可以避免因染色、光源強度的瞬時波動,以及細胞流速的變化和流束與激光束焦點的漂移造成的實驗結果偏差。內(nèi)標法可保證標準樣品與實驗樣品在同樣條件下制備和測量,可使測量誤差降到最小限度。內(nèi)標法在流式細胞測量術中已廣泛應用。4.流式細胞術的參考樣品三、參考樣本的制備方法㈠非生物標準樣本
塑料微球已廣泛應用于參考標準樣品,這些塑料小球可分為兩種:1.無熒光塑料小球可用于散射光的校正,此種統(tǒng)一大小無熒光微球,對于校正儀器光散射是非常有用的。最好采用10μm大小(與正常人淋巴細胞大小相似),通過微球大小的測量,可以對實驗樣品細胞的面積,直徑,橫截面積和體積作出相對大小的判斷。4.流式細胞術的參考樣品2.標記有熒光染料的塑料微球標記熒光染料多選用PI、EB、FITC、AO等,熒光染色的塑料微球可用于調(diào)整和監(jiān)測光散射和熒光信號的檢測。對不同熒光染色細胞所結合的熒光的數(shù)目和細胞體積的大小進行較準確的計算。流式細胞儀對于微球分辨率的大小,取決于微球大小是否一致,分辨率的大小一般用變異系數(shù)(CoeffienceofVariationCV)來表示,目前有的生產(chǎn)廠家出售的商品微球已標明cv值。4.流式細胞術的參考樣品美國生產(chǎn)微球有如下公司的產(chǎn)品:1.DOWDiagnostics2.02μm2.PolyscienCesInc400
ValleyRoadWarrmgtonPA189791.75μm3.BectonDickinsonConpanyProduction1.75μm,2.02μm以上幾種微球在FACS儀器上,光散射CV值為1.2%,熒光CV值為2.2%(為淺黃色熒光)。4.DukeStandardSamPLe5.1μm5.CounterElectronicsInc10μm這兩種微球的CV值為光散射2%,熒光2.8%。4.流式細胞術的參考樣品非生物性塑料小球可作為長期使用于流式的標準樣品,其配制方法和保存方法根據(jù)出售廠家的產(chǎn)品說明。但各種微球多要避光保存,因白炙光可使熒光微球的熒光淬滅。在冰箱內(nèi)保存要防止冷凍結冰和懸液干燥破壞微球,在長期使用過程中或換批號使要做對比鑒定。4.流式細胞術的參考樣品
㈡生物性標準樣品1.某些生物性顆粒
可作為短期標準,例如植物花粉、一些真菌等,可作為體積大小的光散射標準,但是由于其準確性較差,產(chǎn)生誤差較大,且在水中不易保存和易發(fā)生體積大小、光學型號特征等方面的變化,因此很少在流式細胞術中使用。4.流式細胞術的參考樣品⑴雞紅細胞的制備:雞紅細胞在體內(nèi)為一終末細胞,其DNA含量是均一致的,相當于正常人淋巴細胞(二倍體細胞)DNA含量的35%,流式細胞術測定其DNA含量分布組方圖。所得結果為單一狹窄、對稱的正態(tài)峰,在前向光散射組方圖上表現(xiàn)為兩個正態(tài)峰。出現(xiàn)兩個光散射正態(tài)峰的原因是雞血紅細胞呈盤狀,在流過光探測敏感區(qū)時,由于細胞所處的取向不同,造成前向光散射強度不同,因此在光散射組方圖上出現(xiàn)不同大小的光散射信號,即呈兩個正態(tài)分布的組方圖。2.生物細胞標準樣品4.流式細胞術的參考樣品雞血紅細胞即可作為DNA內(nèi)參標準,也可以作為調(diào)整儀器的標準樣品,美國Stanford大學醫(yī)學部成功的使用雞血紅細胞調(diào)試儀器,其CV值最好可達2%,用戊二醛固定的雞紅細胞可發(fā)出自發(fā)熒光,在不染色的條件下,其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與熒光素和羅丹明極接近,美國BecktonDickison生產(chǎn)的FACS儀器上,其熒光分布的單峰CV值在10%左右。雞血紅細胞作為內(nèi)參標準樣品,放入實驗樣品的比例為5~10:100。雞血紅細胞制備簡單,來源豐富,價格低廉,是一種值得提倡的內(nèi)參標準。
4.流式細胞術的參考樣品⑵虹鱒魚紅細胞標準樣品的制備:鱒魚血細胞的DNA含量相當于人二倍體細胞(人淋巴細胞)80%左右,由于其DNA含量接近于人的二倍體細胞,其計算比值產(chǎn)生的誤差較小,鱒魚紅細胞DNA含量均一.近年來,已有大量報道使用該細胞作為DNA定量檢測的內(nèi)參標準或儀器校正的標準樣品,Vindelov等使用鱒魚和雞血細胞作為雙內(nèi)參標準,比較了鱒魚細胞和雞血細胞與二倍體細胞DNA含量的計算比值,結果發(fā)現(xiàn)鱒魚細胞與二倍體細胞DNA比值誤差較小。4.流式細胞術的參考樣品
雞血紅細胞和鱒魚紅細胞DNA含量,隨著其性別差異有所不同.表1雞、鱒魚不同性別紅細胞DNA含量細胞類別雄雌P值雞紅細胞100.096.30.001
鱒魚細胞100.0100.60.0234.流式細胞術的參考樣品⑶人淋巴細胞懸液的制備:正常人外周血中淋巴細胞是一終末細胞,具有細胞核DNA含量均一,細胞體積大小一致,形態(tài)相似的特點,已作為適用的調(diào)整流式細胞儀的生物性參考樣品,并已被確認為一種可靠的二倍體細胞DNA含量的參考標準,在腫瘤細胞DNA倍體的研究中,已廣泛用于DNA倍體的計算標準。4.流式細胞術的參考樣品⑷元魚血細胞的制備:元魚血細胞的核DNA含量相當于人二倍體細胞的70%左右,其核DNA含量均一,形態(tài)大小一致,國內(nèi)已有作者采用元魚細胞作為流式細胞儀的參考指標,其變異系數(shù)可達1.8%左右,遠低于雞血紅細胞。其來源豐富,制備簡單,一只元魚可取10ml血液,在-80oC冰箱中保存兩年以上無任何變化,是實驗中理想的生物性內(nèi)參標準細胞。4.流式細胞術的參考樣品四、DNA定量分析參考標準
Tiersch等選擇了39種脊椎動物細胞,應用流式細胞術定量分析這些動物二倍體細胞的DNA含量(見表2)用于DNA含量分析的參考標準細胞。4.流式細胞術的參考樣品4.流式細胞術的參考樣品4.流式細胞術的參考樣品
標本采集:使用人末梢血淋巴細胞,牛、狗、豬、鼠、馬采用末梢血白細胞,其他動物均采用全血細胞,(這些動物的全血細胞均為有核紅細胞)他們還提出DNA含量的計算公式,DNA含量的單位以微微克或沙克Picogram.Pg10-9/克來表示。
PG=7.0(X/S)(S/H)7.0:二倍體淋巴細胞DNA含量值
X:實驗細胞組方圖中G0/1期細胞峰的均道值
H:人淋巴細胞G0/1峰細胞均道值
S:內(nèi)參考標準細胞G0/1峰的均道值4.流式細胞術的參考樣品對于標準樣品細胞DNA含量的計算,不能使用染色體條數(shù)計算DNA含量。人類的二倍體細胞有46條染色體(DNA含量為7.0),在東南亞有一種小鹿僅有6條染色體,但其二倍體細胞DNA含量與人二倍體細胞DNA含量相似,家馬的二倍體細胞染色體為64條,但其二倍體DNA含量比人的二倍體細胞還少約10%。在使用標準樣品的過程中,不同的染色和不同的固定劑都會出現(xiàn)不同的定量分析結果,作者總結了一些文獻報道和我們所測結果,人的淋巴細胞與雞血紅細胞,鱒魚和元魚紅細胞DNA含量的所測比值(見表3),還有作者報道標準樣品的保存溫度和保持時間也會對測定結果準確性產(chǎn)生影響,因此在使用標準樣品時應嚴格遵照同樣染色方法和固定方法。4.流式細胞術的參考樣品4.流式細胞術的參考樣品五、腫瘤DNA倍體標準㈠新鮮組織細胞DNA倍體定量標準1984年,在洛杉磯召開國際細胞分析學會,就DNA含量分析的二倍體細胞標準作出了規(guī)定:在DNA定量分析時,一般應用同種同一個體的正常細胞DNA含量作為二倍體細胞的標準,禽、魚類紅細胞或熒光微球只能作為儀器準直的標準樣品。因此,人的末梢血淋巴細胞被廣泛用于DNA二倍體標準樣品細胞,在很多腫瘤細胞DNA倍體FCM研究中,也使用了人的淋巴細胞、白細胞和單核細胞等。4.流式細胞術的參考樣品1992年,由美國國立癌癥研究中心,在亞特蘭大組織召開了FCMDNA定量分析的統(tǒng)一標準的國際會議,制定了FCMDNA倍體的標準,嚴格使用DNA二倍體標準樣品,DNA倍體的標準必須:①同種屬,同個體,同樣的正常細胞②同樣的樣品處理方法,同樣的固定方法,同樣的染色方法,和樣品細胞與DNA標準細胞同步染色,即采用內(nèi)參考標準。③采用雙內(nèi)參標準即儀器準直標準細胞和DNA二倍體細胞同時按一定細胞比例加入實驗細胞樣品中去。4.流式細胞術的參考樣品㈡石蠟包埋腫瘤組織DNA倍體分析的標準大量的實驗研究發(fā)現(xiàn),石蠟包埋腫瘤組織的DNA定量分析中,其DNA二倍體標準使用存在的差異比新鮮組織更大。Schutte等研究發(fā)現(xiàn),用新鮮組織二倍體細胞或用末梢血淋巴細胞以及用儀器準直標準作為石蠟包埋腫瘤組織細胞DNA倍體標準更不合適,主要原因在于石蠟包埋組織的固定劑為10%甲醛,如用EB、PI等熒光染色,甲醛固定劑對細胞熒光染色有很強的干擾作用,而且在正常組織細胞之間也存在較大差異。4.流式細胞術的參考樣品我們對各種石蠟包埋的正常組織二倍體細胞DNA含量進行了研究,將人的淋巴細胞DNA含量作為計算標準,將人的淋巴細胞分離出來后,進行石蠟包埋,以70%乙醇固定的雞血紅細胞作為DNA內(nèi)參標準,采用PI同步染色,結果發(fā)現(xiàn),各種正常組織細胞之間DNA含量存在較大的差異(見表4)。各種正常組織細胞之間DNA含量存在差異,推斷,可能各組織細胞之間與熒光染料結合多少有密切關系,熒光染料與DNA結合取決于染色質(zhì)的結構和染色質(zhì)的凝聚程度。4.流式細胞術的參考樣品例如7-AAD(Aminoactionmycin,7-氨基-放線菌素D)與不同的正常組織DNA二倍體細胞結合,可以測定不同的DNA含量結果。例如精子細胞其染色質(zhì)高度凝聚,像PI、EB、AO一些熒光染料不能與其DNA結合,需經(jīng)過酸或熱變性處理后才能被染色。鑒于石蠟包埋組織的二倍體標準細胞DNA含量的定量結果差異較大的特點,對DNA二倍體標準的使用強調(diào)同種、同個體、同源組織,最好在同一個石蠟包埋組織塊中既有正常組織又有腫瘤組織。4.流式細胞術的參考樣品表4人類石蠟包埋正常組織二倍體細胞DNA含量分析正常組織類別例數(shù)DNA比值人淋巴細胞52.93±0.13淋巴結細胞302.91±0.16脾細胞102.87±0.13扁桃體152.90±0.17口腔粘膜222.65±0.21食管粘膜532.65±0.18胃粘膜403.01±2.03腸粘膜253.01±0.16氣管粘膜172.88±0.14肺組織222.77±0.134.流式細胞術的參考樣品腎組織102.81±0.15腎上腺53.11±0.27膀胱粘膜
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2025版高層建筑外架搭設施工分包合同3篇
- 2024年度市政工程施工現(xiàn)場用工合同3篇
- 2025版智能社區(qū)精裝修設計施工一體化合同模板2篇
- 《上海ME美容美發(fā)有限公司稅收征管案例分析》
- 金剛砂耐磨地坪施工合同管理手冊
- 《新型裝配式RC框架柱-柱連接節(jié)點受力性能研究》
- 2025年度健康醫(yī)療客戶隱私保護服務合同
- 二零二五年度員工職業(yè)規(guī)劃發(fā)展資金支持合同
- 2024年網(wǎng)絡購物虛假宣傳賠償合同
- 2025年度冷庫租賃合同(含冷鏈物流設備維護)
- GB/T 33609-2017軟質(zhì)泡沫聚合材料滯后損失試驗方法
- 現(xiàn)當代文學習題(北大、復旦版)
- CypTube激光切割軟件用戶手冊V6.4.0
- 學前兒童健康教育形考任務4試題及答案
- 區(qū)域檢驗中心項目構建書-定稿
- 肺栓塞最新版課件
- 股權轉讓情況明細表
- 安裝手電筒基礎工業(yè)工程課程設計
- 導管相關性血流感染PPT
- 2022年四川省成都市武侯區(qū)七年級上學期期末語文試卷
- 過程開發(fā)流程圖
評論
0/150
提交評論