生化實驗-緒論及蛋白質(zhì)沉淀變性反應(yīng)(共38張課件)

生物化學(xué)實驗室規(guī)那么〔1〕1、遵守紀律，不得無故遲到、早退、大聲談笑。2、預(yù)習(xí)，熟悉實驗?zāi)康?、原理、步驟。3、嚴格聽從教師的指導(dǎo)，及時記錄實驗原始數(shù)據(jù)。4、實驗場所整潔、公用試劑用后放回原位，實驗完畢，清洗實驗器皿、收拾臺面，方可離開。5、注意節(jié)約試劑，防止損壞儀器。使用貴重儀器時，嚴格遵守操作規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障，立即報告教師，不得擅自檢修。生物化學(xué)實驗室規(guī)那么〔2〕6、乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，遠離火源操作及放置。7、所有廢液、廢棄物等，均收集在指定容器內(nèi)，不得倒在水槽內(nèi)或到處亂仍。強酸和強堿不能直接倒在水槽中，應(yīng)先稀釋，然后倒入水槽，再用大量自來水沖洗水槽及下水道。8、室內(nèi)嚴禁吸煙！煤氣、水管用完即關(guān)。Longhairshouldbetiedbacktoavoidburns.Inaddition,avoidwearingloosearticlesofclothingsuchastiesordanglingjewelrythatmaycomeintocontactwithlaboratorysurfaces.實驗室平安--平安用電使用電學(xué)儀器時，要注意電壓、電流是否符合儀器的要求，必要時需使用穩(wěn)壓設(shè)備。嚴格按照電器使用規(guī)程操作，不能隨意拆卸，擺弄電器。嚴防觸電。絕不可用濕手或眼睛旁視時開電閘和電器開關(guān)。檢查電器設(shè)備是否漏電時，應(yīng)使用試電筆。但凡漏電儀器一律不能使用。實驗室平安--防止火災(zāi)起火的原因：有電流短路，不平安地使用電爐、煤氣燈和易燃易爆藥物著火。實驗必須配備一定數(shù)量的消防器材，請按消防規(guī)定保管使用，最重要的是每個實驗者都應(yīng)有實驗室平安觀念，時刻保持警惕。實驗室內(nèi)嚴禁貯存大量的易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇，苯等)。必須存放的少量即將使用的易燃物，也應(yīng)將它放在遠離火源處，火焰熄滅后才可大量傾倒這些液體。低沸點的有機溶劑不準在火焰上直接加熱，只能利用帶回流冷凝管的裝置在水浴上加熱或蒸餾。實驗室平安--防止火災(zāi)2、舉例說明蛋白質(zhì)變性和沉淀之間的關(guān)系。實驗室內(nèi)嚴禁貯存大量的易燃物！常用此法來分離和純化蛋白質(zhì)。機械損傷：立即止血，到醫(yī)院診治。操作戴手套，必要時戴口罩或防毒面具，并在通風(fēng)櫥中進行?；瘜W(xué)試劑有相對無毒、中度毒性和劇毒之分，在處理劇毒藥物時要特別謹慎、小心。②3-4滴3%硝酸銀溶液檢查電器設(shè)備是否漏電時，應(yīng)使用試電筆。實驗報告分為以下幾局部：使用毒性物質(zhì)和致癌物必須根據(jù)試劑瓶上標簽說明嚴格操作，平安稱量、轉(zhuǎn)移和保管。操作戴手套，必要時戴口罩或防毒面具，并在通風(fēng)櫥中進行。實驗室平安--平安用電7、脂肪酶活性的測定 11月14-15濃度較高的蛋白質(zhì)溶液，實驗現(xiàn)象更明顯。用吸量管量取這些試劑(包括有毒物)時，必須使用橡皮球，絕對不能用口吸取。實驗室平安--防止火災(zāi)2021.03.13東南大學(xué)2007.03.28蘭州理工大學(xué)名稱沸點/℃閃點/℃自燃點/℃乙醚34.5－40180丙酮56－17538二硫化碳46－30100苯80－11－乙醇7812400閃點：液體外表的蒸汽和空氣的混合物在遇明火或火花時著火的最低溫度。自燃點：液體蒸汽在空氣中自燃時的溫度。常見有機溶劑的易燃性不能放冰箱中儲存！不能在火源附近儲存、操作！易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限名稱爆炸極限(體積百分數(shù))乙醚1.9～36.5丙酮2.6～13乙醇3.3～19氫氣4.1～74.2甲醇6.7～36.5乙炔3～82實驗室內(nèi)嚴禁貯存大量的易燃物！實驗室平安--嚴防中毒化學(xué)試劑有相對無毒、中度毒性和劇毒之分，在處理劇毒藥物時要特別謹慎、小心。國際上常用某些標志標示不同毒型的化學(xué)藥品。。使用毒性物質(zhì)和致癌物必須根據(jù)試劑瓶上標簽說明嚴格操作，平安稱量、轉(zhuǎn)移和保管。操作戴手套，必要時戴口罩或防毒面具，并在通風(fēng)櫥中進行。沾過毒性、致癌物的容器應(yīng)單獨清洗、處理。實驗室平安--嚴防中毒水銀溫度計、氣量計等汞金屬設(shè)備破損時必須立即采取措施回收汞，并在污染處撒上一層硫磺粉以防汞蒸氣中毒，注意室內(nèi)通風(fēng)。警告標志有輻射性平安布告生物危險品高度可燃的爆炸性的危險化學(xué)藥品標志有毒的腐蝕性的刺激性有害的有氧化作用的氯化鈉優(yōu)級純化學(xué)藥品的質(zhì)量標簽氯化鈉分析純化學(xué)藥品的質(zhì)量標簽氯化鈉化學(xué)純化學(xué)藥品的質(zhì)量標簽實驗室平安--防止燒傷和創(chuàng)傷

使用玻璃、金屬器材時注意防止割傷及機械創(chuàng)傷。如發(fā)生意外，找實驗室工作人員(少量急用藥物備用)。濃酸、濃堿腐蝕性很強，必須極為小心地操作。用吸量管量取這些試劑(包括有毒物)時，必須使用橡皮球，絕對不能用口吸取。實驗室平安--防止火災(zāi)汽油、乙醚等有機溶劑：石棉布、沙土2、了解蛋白質(zhì)的沉淀反響、變性作用和凝固作用的10、 維生素C的定量測定12月5-63、嚴格聽從教師的指導(dǎo)，及時記錄實驗原始數(shù)據(jù)。實驗報告分為以下幾局部：低沸點的有機溶劑不準在火焰上直接加熱，只能利用帶回流冷凝管的裝置在水浴上加熱或蒸餾。強堿：先用大量自來水沖洗，再用5%硼酸溶液或1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.機械損傷：立即止血，到醫(yī)院診治。②數(shù)滴10%三氯乙酸溶液濃度較高的蛋白質(zhì)溶液，實驗現(xiàn)象更明顯。②沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，5、注意節(jié)約試劑，防止損壞儀器。觀察有無沉淀（清蛋白）析出實驗室平安--預(yù)防生物危害微生物、動物的組織、細胞培養(yǎng)物、血液和分泌物都可能存在細菌和病毒感染的潛在危害，處理生物材料必需小心謹慎，做完實驗必須用肥皂、洗滌劑或消毒液洗手。被污染的物品，必須進行高壓消毒或燒成灰燼。被污染的玻璃用具應(yīng)在清洗和高壓消毒前立即浸泡在適當(dāng)?shù)南疽褐?。實驗室急?機械損傷：立即止血，到醫(yī)院診治。強堿：先用大量自來水沖洗，再用5%硼酸溶液或

2%乙酸溶液涂洗。強酸：大量自來水沖洗，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌。酚：用酒精洗滌。煤氣中毒：立即到室外，嚴重者就醫(yī)。實驗室急救2玻璃割傷：檢查傷口內(nèi)有無玻璃碎片，硼酸水洗凈，涂擦碘酒或紅汞水，必要時用紗布包扎。燙傷：濃酒精消毒，涂上苦味酸軟膏。觸電：關(guān)閉電源用干木棍使電線與被害者分開。著火：汽油、乙醚等有機溶劑：石棉布、沙土電線：切斷電源或用四氯化碳滅火器衣服：勿奔波，濕衣包裹或躺地滾動。實驗報告的撰寫實驗報告分為以下幾局部：原理實驗步驟結(jié)果與討論問答實驗成績的評定：實驗報告平時操作、表現(xiàn)姓名，班級，學(xué)號，課室，實驗時間、實驗教師實驗內(nèi)容及安排(

72學(xué)時)1、緒論、蛋白質(zhì)沉淀、變性反響 9月26-272、蛋白質(zhì)濃度測定—考馬斯亮藍法 10月10-113、陽離子交換樹脂層析別離氨基酸10月17-184、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 10月24-255、聚丙烯酰胺凝膠電泳別離血清蛋白10月31-11月16、影響酶促反響速度因素—最適pH、激活劑〔抑制劑〕 11月7-87、脂肪酶活性的測定 11月14-158、過氧化氫酶米氏常數(shù)測定 11月21-22實驗內(nèi)容及安排〔續(xù)〕9、糖的定量測定11月28-2910、 維生素C的定量測定12月5-611、 脂肪酸B氧化作用12月12-1312、轉(zhuǎn)氨基作用12月19-2013、魚類DNA的提取 12月26-2714 、核酸濃度測定－UV吸收法 1月2-315 、聚合酶鏈式反響〔PCR〕 1月2-316 、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1月9-10一、實驗?zāi)康?、了解蛋白質(zhì)的一些理化性質(zhì)，認識蛋白質(zhì)的可逆反響和不可逆反響。2、了解蛋白質(zhì)的沉淀反響、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關(guān)系。實驗一蛋白質(zhì)沉淀、變性反響蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物,其分子量頗大，介于一萬到百萬之間，是一種親水膠體。蛋白質(zhì)分子外表的親水基團〔-OH,-COOH,-NH3,以及肽鍵〕等，在水溶液中能與水分子起水化作用〔Hydration〕，使蛋白質(zhì)分子外表形成一個水化層。每克蛋白質(zhì)分子能結(jié)合克水。蛋白質(zhì)分子外表上的可解離基團，在適當(dāng)?shù)腜H條件下，都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。二、實驗原理由于蛋白質(zhì)溶液具有水化層和雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以膠體系統(tǒng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。在一定物理化學(xué)因素(如鹽析、重金屬離子、有機酸、無機酸和加熱)影響下,蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質(zhì)的沉淀反響。這種反響可分為兩種類型：1、可逆沉淀反響：蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，根本保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能溶于原來的溶劑中。2、不可逆沉淀反響：蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)。蛋白質(zhì)溶液的沉淀

穩(wěn)定是相對的，有條件的。

如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)分子外表水化層雙電層穩(wěn)定的親水膠脫水，失去電荷沉淀反響可逆沉淀反響〔不變性沉淀反響〕如：鹽析作用…不可逆沉淀反響〔變性沉淀反響〕如：重金屬鹽沉淀作用…蛋白質(zhì)沉淀變性的常見方法

常用方法原理常用試劑實用鹽析破壞蛋白質(zhì)膠體溶液的水化層和電荷層(NH4)2S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04常用此法來分離和純化蛋白質(zhì)。有機試劑鹽析脫水作用；降低水的介電常數(shù)和蛋白質(zhì)溶解度；蛋白質(zhì)析出乙醇、丙酮、甲醇低溫乙醇提取血液中的蛋白質(zhì)組分強酸、強堿沉淀破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生蛋白質(zhì)變性鹽酸,硫酸,硝酸、氫氧化鈉

滅活病毒加熱變性雞蛋、肉類等加工重金屬鹽沉淀變性；生成不溶性鹽Ag+，Hg2+，Cu2+和Pb2+臨床上常用蛋清或牛乳解救誤服重金屬鹽的病人有機酸沉淀生成不溶性鹽苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等生物堿試劑沉淀蛋白濾液等三、實驗材料及設(shè)備蛋白質(zhì)溶液：取10ml鮮雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌后用4-8層紗布過濾，新鮮配制。蛋白質(zhì)氯化鈉溶液：取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液l00ml，充分攪勻后用4-8層紗布濾去不溶物〔加氯化鈉的目的是溶解球蛋白〕。1.材料2.試劑3%硝酸銀，0.5%乙酸鉛，10%三氯乙酸溶液，飽和硫酸銨溶液，10%氫氧化鈉溶液，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5%磺基水楊酸，0.1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，飽和氯化鈉溶液，硫酸銨粉。3.器材水浴鍋,漏斗,濾紙,吸管,試管及試管架,量筒等。四、實驗內(nèi)容1.蛋白質(zhì)的可逆反響——蛋白質(zhì)的鹽析步驟現(xiàn)象解釋結(jié)論取一支試管，加入3mL蛋白質(zhì)氯化鈉溶液和等量的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置10分鐘觀察有無蛋白質(zhì)（球蛋白）的沉淀過濾后，向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，直至飽和觀察有無沉淀（清蛋白）析出靜置，棄去上清液，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水觀察沉淀的再溶解操作現(xiàn)象操作現(xiàn)象Tube1①1mL蛋白質(zhì)溶液②3-4滴3%硝酸銀溶液③過量的硝酸銀Tube2①1mL蛋白質(zhì)溶液②1-3滴0.5%乙酸鉛③過量的乙酸鉛Tube3①1mL蛋白質(zhì)溶液②3-4滴0.1%硫酸銅③過量的硫酸銅2.蛋白質(zhì)的不可逆反響2.1.重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)〔3支試管〕操作現(xiàn)象Tube1①0.5mL蛋白質(zhì)溶液②數(shù)滴10%三氯乙酸溶液

Tube2①0.5mL蛋白質(zhì)溶液②數(shù)滴5%磺基水楊酸2.蛋白質(zhì)的不可逆反響2.2有機酸沉淀蛋白質(zhì)〔2支試管〕操作現(xiàn)象操作現(xiàn)象Tube115滴濃鹽酸

②沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，

勿搖③振蕩Tube2①15滴濃硫酸沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，勿搖

③振蕩Tube3①15滴濃硝酸②沿管壁加入6滴蛋白質(zhì)溶液，

勿搖③振蕩2.蛋白