生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-PCR實(shí)驗(yàn)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

——PCR實(shí)驗(yàn)（聚合酶鏈反應(yīng)）PCR原理PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。PCR的起始材料是一個(gè)基因或片段的DNA模版，雙鏈DNA分子的互補(bǔ)鏈經(jīng)加熱后解開，形成單鏈；引物（兩條合成短單鏈DNA，分別與模版DNA的特定序列互補(bǔ)）與互補(bǔ)序列相結(jié)合；四種三磷酸脫氧核苷酸（dATP,dCTP,dGTP,dTTP）存在時(shí)，聚合酶從引物處從5至3`端合成互補(bǔ)鏈。多次循環(huán)后，模版DNA序列的含量大大增加，用于研究分析。PCR過程1.變性(denaturation)：一般在92～96℃。模板及新合成的雙鏈DNA都變性成為單鏈，該步驟一般只需30s～lmin。2.退火(annealing)：一般在37～65℃。引物特異地結(jié)合到變性后的單鏈DNA上。這一步驟一般需30s～lmin。3.延伸(extension)：溫度一般為72℃，時(shí)間為1～2min。DNA聚合酶根據(jù)模板的順序，在引物3’端接上一個(gè)三磷酸脫氧核苷酸，從而使新合成的互補(bǔ)鏈不斷延伸。PCR產(chǎn)物一般為幾百個(gè)堿基對(bp)，長的可達(dá)幾十千個(gè)堿基對(kb)。如果需要合成長片段則可適當(dāng)延長時(shí)間。上述3步驟為1個(gè)PCR循環(huán)，DNA片段就增加1倍。反復(fù)循環(huán)反應(yīng)，DNA分子數(shù)呈指數(shù)增長，即2n(n為循環(huán)次數(shù))。DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳原理不同大小和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等）有不同的遷移率，可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可染料溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。操作步驟（一）凝膠制備瓊脂糖0.8g放入250ml的三角燒杯中，加入100ml1×TAE緩沖液，混勻后，將燒瓶置于電爐上，加熱煮沸，至瓊脂糖完全溶解，冷卻至70℃左右時(shí)加入溴化乙錠（10mg/ml）5μl，混勻后，即將凝膠溶液倒入凝膠成形模具，室溫下待凝膠完全凝固。（二）上樣電泳將凝膠板放入電泳槽中，在電泳槽中加入1×TAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。PCR產(chǎn)物管中加入上樣緩沖液，混勻后用加樣器加入凝膠樣品孔中。接通電源，調(diào)節(jié)電壓至50~100伏，電泳45分鐘。（三）觀察結(jié)果電泳后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察。儀器與器材1、電泳儀2、水平式核酸電泳槽3、紫外凝膠成像儀試劑與材料1、瓊脂糖2、6×點(diǎn)樣緩沖渡：0.25%溴酚蘭、40%蔗糖3、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：λDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：λDNA/HindⅢ4、50×TAE電泳緩沖液貯存液配方：（50×）每升242gTris57.1ml冰醋酸100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）5、0.8%瓊脂糖：0.8g瓊脂糖用100ml1×TAE沸水浴溶解6、10mg/mlEB

1.0g溴乙錠

100ml三蒸水PCR結(jié)果PCR實(shí)驗(yàn)常見失敗原因、對策分析及體系優(yōu)化PCR雖然為一個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn)，但在實(shí)際過程中可能會(huì)出現(xiàn)各種問題。產(chǎn)生問題的原因可能來源于以下幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)操作，試劑質(zhì)量，PCR反應(yīng)過程中各種試劑的含量，以及反應(yīng)條件，溫度設(shè)置等，本文對各個(gè)方面進(jìn)行了討論，大家遇到問題后可以對號入座的查一下。當(dāng)然，具體問題的解決還依靠實(shí)驗(yàn)者就可能的原因逐項(xiàng)排除，并不斷的摸索才能徹底解決。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(9