肺泡灌洗液二代測序在重癥肺炎患者中的應(yīng)用

肺泡灌洗液二代測序在重癥肺炎患者中的應(yīng)用摘要：目的探討肺泡灌洗液二代測序在重癥肺炎患者中的應(yīng)用效果。方法選取2022年1月至2022年6月在我院急診科收治的30例重癥肺炎并行肺泡灌洗液二代測序的患者為研究對象，按照檢測方法分常規(guī)組和觀察組，各15例。常規(guī)組患者進(jìn)行普通微生物培養(yǎng)，觀察組在對照組的基礎(chǔ)上采用肺泡灌洗液mNGS檢測。比較兩組患者檢測的病原菌的數(shù)量和分布情況、靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率。結(jié)果：常規(guī)組G－菌(17株)

、G＋菌(11株)、病毒(9株)、真菌(2株)、檢出均低于觀察組G－菌(33株)、G＋菌(25株)、病毒(17株)、真菌(3株)；常規(guī)組患者檢測的靈敏度為（83.67%）、特異度為（53.33%）、準(zhǔn)確率（60.00%），低于觀察組患者檢測的靈敏度為（100.00%）、特異度為（100.00%）、準(zhǔn)確率（93.33%），兩組檢測方法相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：對重癥肺炎患者采用肺泡灌洗液mNGS檢測其病原菌的靈敏度及特異度更高。

關(guān)鍵詞：肺泡灌洗液二代測序；重癥肺炎；病原菌；應(yīng)用效果肺炎(pneumonia)具備下述前4項(xiàng)中任何1項(xiàng)加上第5項(xiàng)，并除外肺結(jié)核、肺部腫瘤、非感染性肺問質(zhì)性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤癥、肺血管炎等即可診斷。包括：①新近出現(xiàn)的咳嗽、咯痰或原有呼吸道癥狀加重，出現(xiàn)膿性痰，伴或不伴胸痛；②發(fā)熱；③肺實(shí)變體征和(或)濕性噦音；④外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)>10×109／L或<4×109／L，伴或不伴核左移；⑤胸部影像學(xué)檢查顯示新出現(xiàn)片狀、斑片狀浸潤性陰影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液[1]。社區(qū)獲得性肺炎(community-acquiredpneumonia,CAP)是指在醫(yī)院外罹患的感染性肺實(shí)質(zhì)(含肺泡壁,即廣義上的肺間質(zhì))炎癥,包括具有明確潛伏期的病原體感染而在入院后潛伏期內(nèi)發(fā)病的肺炎[2]。其重癥者稱為重癥社區(qū)獲得性肺炎(severecommunity-acquiredpneumonia，SCAP）。醫(yī)院獲得性肺炎（hospital-acquiredpneumonia，HAP）是指患者入院時(shí)不存在，也不處于感染潛伏期內(nèi)，而于人院48h后在醫(yī)院發(fā)生的肺炎，其重癥者稱為重癥醫(yī)院獲得性肺炎(severehospital—acquiredpneumonia，SHAP)。肺部感染病原菌的分布以及耐藥情況有了很大的變遷，為及時(shí)了解患者肺部感染病原菌的變遷及耐藥情況[3]。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展宏基因組二代基因測序（MetagenomicNext-generationSequencing，mNGS）技術(shù)的也在不斷提高，目前，mNGS在臨床檢測當(dāng)中，已成為最常見且有效的檢測手段。本次研究旨在探討肺泡灌洗液二代測序在重癥肺炎病原菌患者中的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。1一般資料與方法1.1一般資料選取在我院急診科收治的30例重癥肺炎為研究對象，按照檢測方法分常規(guī)組和觀察組，各15例。其中常規(guī)組中9例女性，6例男性，年齡在48歲至73歲，平均（60.68±1.43）歲，初中及以下7例，高中5例，高中以上3例；觀察組8例女性，7例男性，年齡在39歲至74歲，平均（61.29±1.26）歲，初中及以下5例，高中6例，高中以上4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者符合重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）患者臨床資料完整：（3）患者無其他慢性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者對藥物過敏；（2）患者存在精神障礙；（3）患者依從性不高。兩組在一般資料當(dāng)中，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。1.2方法常規(guī)組支氣管肺泡灌洗和BALF收集重癥MPP是支氣管肺泡灌洗的適應(yīng)證。支氣管鏡檢查由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師操作。在咪達(dá)唑侖靜脈鎮(zhèn)靜下，經(jīng)鼻進(jìn)鏡，使用2%的利多卡因氣道黏膜表面麻醉。到達(dá)病變部位時(shí)，將支氣管鏡末端楔入病變段或肺葉，經(jīng)氣管鏡工作通道注入溫?zé)嵘睇}水進(jìn)行灌洗，每次20-50ml，總量60-120ml，灌洗后立刻抽吸，抽吸壓力為100mmHg，將回吸收的BALF吸收至痰液收集器中。留取收集到的BALF5-10mL置于冰箱4℃保存，24h內(nèi)送檢微巖醫(yī)學(xué)進(jìn)行mNGS病原檢測。剩余BALF常規(guī)送檢驗(yàn)科進(jìn)行呼吸道病原抗原9項(xiàng)檢測（呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒A、B型、偏肺病毒、鼻病毒、沙眼衣原體DNA和肺炎支原體DNA）、BALF培養(yǎng)、真菌GM試驗(yàn)及抗酸染色涂片。觀察組采用肺泡灌洗液mNGS檢測，即：（1）樣本護(hù)理和DNA提取：取0.5～3ml痰夜，經(jīng)玻璃珠混合震蕩后依據(jù)TIANampMicroDNAKit試劑盒步驟提取DNA。（2）文庫構(gòu)建和測序：應(yīng)用Agilent2100Bioanalyzer質(zhì)控文庫片段大小，應(yīng)用QubitdsDNAHSAssayKit質(zhì)控分析DNA文庫濃度，環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。文庫環(huán)化后經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球，將其加載到測序芯片，通過BGISEQ-500測序。（3）數(shù)據(jù)分析：將長度小于35bp和低質(zhì)量數(shù)據(jù)去除，通過BWA對比，去除高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因序列，剩下數(shù)據(jù)將低復(fù)雜度reads去除后，和專用微生物大數(shù)據(jù)比對，按照細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲將比對后數(shù)據(jù)進(jìn)行分類和排列。依據(jù)檢出毒力基因、耐藥基因的信息應(yīng)用抗菌藥物治療。1.3觀察指標(biāo)和評價(jià)觀察分析兩組患者痰液、血液、BALF標(biāo)本中病原菌的數(shù)量和分布情況（G－菌、G＋菌、病毒、真菌）、靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采取X2檢驗(yàn)，若P＜0.05，則表明差異有顯著性，若P＞0.05，則表明差異沒有顯著性。2結(jié)果2.1病原菌的數(shù)量和分布情況常規(guī)組G－菌(17株)、G＋菌(11株)、病毒(9株)、真菌(2株)、檢出均低于觀察組G－菌(33株)、G＋菌(25株)、病毒(17株)、真菌(3株)；詳情見表1。表1兩組病原菌的數(shù)量和分布情況常規(guī)組觀察組病原體株數(shù)總構(gòu)成比（%）病原體株數(shù)總構(gòu)成比（%）G－菌(17株)G－菌(33株)銅綠假單孢菌529.41銅綠假單孢菌824.24流感嗜血桿菌317.65流感嗜血桿菌618.18大腸埃希菌211.76大腸埃希菌515.15嗜肺軍團(tuán)菌423.53嗜肺軍團(tuán)菌721.21肺炎克雷伯菌317.65肺炎克雷伯菌721.21G＋菌(11株)G＋菌(25株)腸球菌屬436.36腸球菌屬728.0金黃色葡萄球菌327.27金黃色葡萄球菌832.0肺炎鏈球菌436.36肺炎鏈球菌1040.0病毒(9株)病毒(17株)腺病毒444.44腺病毒758.82甲型流感333.33甲型流感635.29乙型流感222.22乙型流感423.53真菌(2株)真菌(3株)黃曲霉150.0黃曲霉266.67青霉菌150.0青霉菌133.332.2兩組靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率比較常規(guī)組患者靈敏度為、特異度為及準(zhǔn)確率，均低于觀察組患者，兩組檢測方法相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳情見表2。表2兩組兩組靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率比較組別靈敏度特異度準(zhǔn)確率常規(guī)組（n=15）83.6753.3360.00觀察組（n=15）100.00100.0093.33X27.31810.60411.888P<0.05<0.05<0.053討論重癥肺炎具有病情進(jìn)展快、死亡率高的特點(diǎn)，患者伴有呼吸衰竭癥狀，嚴(yán)重情況下，可出現(xiàn)昏迷、意識障礙等癥狀，從而誘發(fā)腦疝，可能因中樞性呼吸衰竭導(dǎo)致死亡[4]。該病還可累及循環(huán)系統(tǒng)，具體癥狀為心率加快、肺部啰音增加、脈搏微弱等，當(dāng)發(fā)生休克時(shí)，面色蒼白，血壓降低[5]。盡早明確其病原體類型至關(guān)重要，能為疾病干預(yù)提供依據(jù)，選擇針對性藥物予以治療。然而，重癥肺炎因病情進(jìn)展迅速，既往采用傳統(tǒng)方法行常規(guī)病原體檢測，由于受到條件限制，可能無法完全反映細(xì)菌豐富度與類別，高通量測序的效果則更顯著[6]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展，mNGS技術(shù)在病原菌檢測中被應(yīng)用，體現(xiàn)出較多優(yōu)勢。該技術(shù)無需行微生物培養(yǎng)，可直接對相關(guān)基因組遺傳物質(zhì)進(jìn)行提取，從而分析微生物群體，對菌群的檢測更加真實(shí)、可靠[7]。隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的病原分布有了較大的變遷，感染菌的復(fù)雜性和耐藥性給臨床治療帶來許多困難。本研究常規(guī)組G－菌(17株)

、G＋菌(11株)、病毒(9株)、真菌(2株)、檢出均低于觀察組G－菌(33株)、G＋菌(25株)、病毒(17株)、真菌(3株)。分析認(rèn)為可能與大部分病例在入院前使用過抗生素，導(dǎo)致L型細(xì)菌的產(chǎn)生影響檢出率以及某些菌種對培養(yǎng)環(huán)境的要求較高導(dǎo)致漏檢有關(guān)。另外，從細(xì)菌耐藥性方面分析看出，革蘭氏陰性菌在肺炎的細(xì)菌病原分布中占主要部分，對常用抗生素的敏感性在逐步降低，耐藥菌株在逐步增加。因此，作者認(rèn)為，呼吸道感染患者應(yīng)盡快進(jìn)行痰培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果給臨床提供參考，幫助其合理選擇抗生素，杜絕亂用、濫用抗生素，減輕患者的負(fù)擔(dān)。本研究顯示，觀察組檢測準(zhǔn)確率（93.33%）高于常規(guī)組（60.00%），提示mNGS檢測效果更理想。mNGS檢測被證實(shí)可對DNA病毒、細(xì)菌同時(shí)予以檢測，而傳統(tǒng)檢測方法則無法滿足該需求[8]。在本研究中，mNGS檢測采用了高通量測序技術(shù)，且直接對樣品總DNA進(jìn)行提取，可使細(xì)胞徹底裂解，即便細(xì)胞附著于顆粒上，也能取得較可靠破碎效果。研究認(rèn)為，在mNGS檢測中利用直接提取原理對DNA進(jìn)行提取，可減少DNA流失，從而使微生物結(jié)構(gòu)更加完整。因此，采用這種方式，能取得更好的檢測效果。綜上所述，重癥肺炎患者采用肺泡灌洗液mNGS檢測其病原菌中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，檢測的靈敏度及特異度較高，其準(zhǔn)確率也高，總體檢出效果較理想，且可為臨床治療提供依據(jù)。參考文獻(xiàn)：[1]中國急診重癥肺炎臨床實(shí)踐專家共識[J].中國急救醫(yī)學(xué).2016,36(2):91-107.[2]徐玉惠.宏基因組二代測序技術(shù)在重癥肺炎病原學(xué)檢測中的價(jià)值[D].吉林大學(xué),2021.[3]陳友蓮,劉雪燕,陳懷生,等.肺泡灌洗液宏基因組二代測序技術(shù)在重癥肺炎患者中的臨床價(jià)值[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2022,38(01):31-34.[4]戴媛媛,馬筱玲.宏基因組二代測序技術(shù)在臨床病原學(xué)診斷中的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2021,39(01):1-5.[5]孫國先,劉微麗,鄭慶斌,等.肺泡灌洗液二代測序在重癥肺炎病原菌未明患者中的應(yīng)用[J].中國