分析IA-IIB肺腺癌的特異性生物標(biāo)志物的檢測技術(shù)原理

分析IA-IIB肺腺癌的特異性生物標(biāo)志物的檢測技術(shù)原理摘要：根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，肺癌患者數(shù)量占據(jù)癌瘡首位，并且死亡率高。所以尋找癌癥治療方法迫在眉睫。在臨床指南中，對于肺腺癌患者術(shù)后的治療方案非常模糊。術(shù)后無法進(jìn)行有效的精準(zhǔn)評(píng)估，并且復(fù)發(fā)頻率高難以預(yù)測。其根本原因是尚未發(fā)現(xiàn)患者的癌細(xì)胞特征驅(qū)動(dòng)基因。因此追蹤癌細(xì)胞的復(fù)制與進(jìn)化產(chǎn)生的不同癌細(xì)胞的類群顯得格外重要。本文重點(diǎn)相繼從組織水平，蛋白水平，RNA水平，DNA水平上探討特征化肺癌細(xì)胞進(jìn)行分割化治療。本文通過比較四種檢測原理明確在DNA水平上進(jìn)行基因突變檢測能夠客觀的研究癌細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對IA-IIB肺腺癌進(jìn)行分子分型。明確驅(qū)動(dòng)基因和繼發(fā)基因突變，為尋找藥物提供有力保障。手術(shù)后，對循環(huán)血液中殘留腫瘤DNA進(jìn)行深度測序，一次判斷患者身上的微小殘留病灶的多少。以此來評(píng)估治療療效以及預(yù)測復(fù)發(fā)的可能性。通過比較四個(gè)水平上的檢測原理，發(fā)現(xiàn)只有DNA水平上進(jìn)行基因檢測最有前景，可成為癌癥精準(zhǔn)醫(yī)療方法。關(guān)鍵詞：肺腺癌；檢測技術(shù)原理；DNA突變；二代測序技術(shù)。前言：根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，肺癌是最常見的實(shí)體瘤之一，每年有1.61百萬的患者，有1.38百萬的患者死于肺癌。肺癌沒有感染力和其傳播途徑。對于其是否通過遺傳方式傳播也還是疑問。肺癌的首發(fā)大約是1-10年。復(fù)發(fā)期是0-5年。其致死率極高，占中國所有癌癥死亡人數(shù)的27%。肺癌已成為目前醫(yī)療領(lǐng)域的主要負(fù)擔(dān)，消耗大量的醫(yī)療資源。在我國的癌癥病發(fā)率的統(tǒng)計(jì)中，有22.7%的癌癥患者屬于肺癌。所以對于肺癌的研究與治療對于人類至關(guān)重要。（一）組織學(xué)常用檢測技術(shù)原理及應(yīng)用：石蠟切片技術(shù)：是組織學(xué)中最常見的制片方法之一，用于觀察組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)，以及研究組織細(xì)胞的形態(tài)變化。其主要步驟有：1.采用適當(dāng)化學(xué)液固定細(xì)胞，并維持其活細(xì)胞形態(tài)。2.采用從低濃度到高濃度的無水乙醇處理樣品，從而達(dá)到脫水的目標(biāo)。3.使用媒浸液將組織內(nèi)的酒精置換出。4.將組織樣本放入熔化的石蠟中進(jìn)行包埋。5.完成包埋后，用切片機(jī)對樣本進(jìn)行切片。6.將恒溫水浴鍋的溫度設(shè)定在37C，展開切片，將展開的貼片放置在恒溫箱內(nèi)干燥大約兩小時(shí)，恒溫箱溫度設(shè)置為60C。7.使用二甲苯中對切片進(jìn)行脫蠟處理。一次使用95%、85%、70%濃度的酒精對樣品進(jìn)行水化處理。整個(gè)過程大概需要耗時(shí)24h。蘇木精伊紅染色技術(shù)：是病理組織學(xué)切片中最廣泛使用的一種染色方法。蘇木精染色液體會(huì)與細(xì)胞核反應(yīng)，將細(xì)胞核染色成深淺程度不一的藍(lán)色。伊紅染色液體會(huì)與蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合，將細(xì)胞胞漿染色長程度不一的紅色。藍(lán)色與紅色的細(xì)胞核形成鮮明對比，直觀的觀測到組織中細(xì)胞核的增值情況。蘇木精伊紅染色有以下幾個(gè)步驟。1.將處理好的樣品放入蘇木素染色液中5-10分鐘。2.將樣品浸在自來水中，洗去多余的染色液。3.再用蒸餾水洗滌。4.根據(jù)不同分化液體的分化時(shí)間進(jìn)行分化。5.用伊紅染色樣品，30s至2mins的范圍內(nèi)。6.用70%乙醇洗滌2次，如需脫水、透明后封片按后續(xù)步驟進(jìn)行，70%乙醇洗滌后仍可按照后續(xù)步驟進(jìn)行脫水、透明和封片處理。根據(jù)染色情況知道細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例，以此推測組織癌變情況。缺點(diǎn)是，只知道組織細(xì)胞形態(tài)，不知道癌細(xì)胞的具體位置。（二）蛋白質(zhì)表達(dá)量腫瘤標(biāo)識(shí)物是指在腫瘤的發(fā)生和增值過程中生成的特定物質(zhì)。通過測量血清中腫瘤標(biāo)識(shí)物的含量，可以有效的推斷腫瘤在人體體內(nèi)的發(fā)展情況。檢測患者的腫瘤標(biāo)識(shí)物的水平有助于早期診斷，以及評(píng)估治療效果。其中CA19-9屬于重要的腫瘤標(biāo)識(shí)物。CA19-9的水平高低可以提醒手術(shù)難易程度，并且對術(shù)后的情況進(jìn)行有效評(píng)估。CA19-9檢測技術(shù)，雖然可以檢測腫瘤增長的程度，并且確定癌細(xì)胞的特殊特征。但是無法檢測基因?qū)用妗Ｋ孕枰诟蛹?xì)致的RNA層面上對癌癥進(jìn)行檢測。（三）FISH技術(shù)技術(shù)原理如下：RNA熒光原位雜交技術(shù)可以確定特定RNA序列。其技術(shù)的主要步驟為：使組織切片進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，使用核糖核酸酶H對mRNA進(jìn)行降解。向互補(bǔ)DNA環(huán)境中加入大量探針，等待探針與DNA上的堿基充分反映。然后除去環(huán)境中的剩余探針，再向目標(biāo)DNA加入特異性熒光基團(tuán)，使其與不同探針進(jìn)行配對。最后達(dá)到對DNA序列上的各種堿基可視化的目的。（四）DNA突變與基因檢測技術(shù)在DNA層面上，所有的癌癥都是由于基因的突變而產(chǎn)生的。本段落重點(diǎn)介紹單堿基突變。4.1單堿基DNA突變的三種結(jié)果：單堿基突變指DNA序列中其中一個(gè)堿基發(fā)生了改變。其改變分為缺失或增添，到位或移位。單堿基突變會(huì)產(chǎn)生三種可能。第一種可能是同義突變。DNA堿基是由每三個(gè)堿基為一組成為一個(gè)密碼子。由于人體的密碼子有六十四對，而人體中所存在的氨基酸只有二十個(gè)。所有一些單堿基突變造成密碼子的改變最終并不會(huì)影響其氨基酸的匹配。第二種可能是堿基替換可能是一種錯(cuò)義突變，即改變的密碼子對應(yīng)于不同的氨基酸。第三種可能是無意突變，其堿基突變的密碼子對應(yīng)停止信號(hào)。4.2三種點(diǎn)突變：第一種為缺失/增添，在基因序列上加入一個(gè)核苷酸對，或者從基因序列上減去一個(gè)核苷酸對。如果一個(gè)核苷酸對被加到這個(gè)序列上或從這個(gè)序列上減去一個(gè)核苷酸對，從那個(gè)點(diǎn)開始的閱讀框?qū)⒈灰粋€(gè)核苷酸對移動(dòng)，所有下游的密碼子都將被改變。其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致所生成的蛋白質(zhì)由正常氨基酸序列和無功能意義的氨基酸序列兩部分組成。移位會(huì)導(dǎo)致十分嚴(yán)重的功能喪失。第二種為轉(zhuǎn)換突變，指一個(gè)嘧啶堿基取代另一個(gè)嘧啶堿基，或者是一個(gè)嘌呤堿基取代另一個(gè)嘌呤堿基。胞嘧啶和胸腺嘧啶是人體基因序列上的兩種嘧啶堿基，腺嘌呤和鳥嘌呤是人體基因序列上的兩種嘌呤堿基。轉(zhuǎn)換突變的可能只存在在兩種相同堿基的轉(zhuǎn)換。第三種為逆轉(zhuǎn)突變，一個(gè)嘌呤堿基取代一個(gè)嘧啶堿基。4.3一代測序：Sanger測序是利用電泳技術(shù)，對與DNA堿基進(jìn)行分離并且排序。完成之后用X膠片光放射，顯示各個(gè)堿基在核算片段中的位置。其具體步驟分為四步。單個(gè)目的基因序列。再利用PCR體外擴(kuò)增技術(shù)，對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行大量克隆。然后在待測樣品中加入四種dNT以及ddNTP。對DNA序列進(jìn)行電泳，再利用X膠片光放射得到目標(biāo)DNA的具體序列信息。其優(yōu)點(diǎn)為精準(zhǔn)度高，測序時(shí)間短。缺點(diǎn)為對于大量DNA測序所需價(jià)格昂貴，并且每次測序的目標(biāo)DNA只能一小段。（五）現(xiàn)代常用的檢測技術(shù)5.1實(shí)時(shí)定量PCR：PCR技術(shù)將少量基因序列進(jìn)行體外擴(kuò)增，利用瓊脂電泳技術(shù)獲取制定核算序列。PCR擴(kuò)增技術(shù)使用DNA聚合酶，核苷酸和引物。將人工合成的DNA單鏈引物與模版DNA結(jié)合，以dNTP為底物。利用DNA聚合酶沿著模版雙鏈進(jìn)行合成新的DNA片段形成DNA的體外擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟為：第一步：配置反應(yīng)：將緩沖劑，<0.4mM濃度的dNTPs，<0.4uM濃度的正向引物,<0.4mM濃度的反向引物,<100ng濃度的DNA樣本，5U濃度的熱啟動(dòng)酶，Upto50ul濃度的ddH2O加入到離心管中。使用熱啟動(dòng)酶啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。第二步：等待擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳鑒定。第三步：按照目標(biāo)DNA片段大小制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠，并加入電泳緩沖液。將液體加熱到40攝氏度。將電泳緩沖液加入到電泳槽中。第四步：將樣品加入到點(diǎn)樣孔中。第五步：對電泳進(jìn)行通電。第六步：關(guān)閉電源，根據(jù)DNA片段所處位置獲取目標(biāo)基因片段。PCR擴(kuò)增技術(shù)，幫助臨床診斷和分子生物學(xué)研究。5.2qPCR:PCR技術(shù)使得小量的DNA樣品可以轉(zhuǎn)化為大量的DNA樣品。PCR技術(shù)通常被看作是其他技術(shù)的一個(gè)步驟而不是一個(gè)測序工具。qPCR在PCR的基礎(chǔ)上增加了熒光染料和熒光劑。反應(yīng)過程中需要熱循環(huán)儀來檢測熒光。熒光計(jì)在熱循環(huán)器運(yùn)行時(shí)實(shí)時(shí)檢測熒光，在PCR擴(kuò)增過程中給出讀數(shù)。其反應(yīng)過程稱為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。qPCR產(chǎn)生的讀數(shù)提供了關(guān)于原始非逆轉(zhuǎn)錄樣本中難以測量的mRNA數(shù)量的信息。qPCR運(yùn)行產(chǎn)生的數(shù)據(jù)類型很大程度上取決于所使用的引物和染料。5.3二代測序技術(shù)（NGS技術(shù)原理及優(yōu)勢）：Sanger測序在近十年當(dāng)中占主要的DNA測序方式，但是其目標(biāo)片段小，無法微量化的局限性無法滿足大范圍精準(zhǔn)的DNA測序。（1)相比之下，二代測序技術(shù)在PCR的技術(shù)上，利用高性能的計(jì)算機(jī)進(jìn)行大范圍的測序。高通量測序打破了Sanger測序的局限性，可以檢測10，000以上的堿基數(shù)量（2）這在生命科學(xué)領(lǐng)域上是極大的突破，也極大的促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展。NGS測序的應(yīng)用：血液循環(huán)系統(tǒng)中殘留的腫瘤DNA檢測。當(dāng)病人經(jīng)歷手術(shù)成功切除腫瘤后，NGS幫助醫(yī)生判斷患者是否治愈，或者還是存在殘留病灶。當(dāng)DNA死亡，或者腫瘤死亡后。其會(huì)流入到血壓當(dāng)中。如果使用NGS技術(shù)檢測到體內(nèi)殘留腫瘤釋放出的突變DNA，說明身上有殘留的病灶，治療不完全。NGS測序技術(shù)幫助醫(yī)生對臨床患者的療效進(jìn)行評(píng)估。參考文獻(xiàn)：Larsson,C.,Grundberg,I.,S?derberg,O.,andNilsson,M.(2010).

Insitu

detectionandgenotypingofinpidualmRNAmolecules.

Nat.Methods

7,395–397.doi:10.1038/nmeth.1448NiestersHG,ZoulimF,PichoudC,etal.ValidationoftheINNOLiPAHBVDRassay(version2)inmonitoringhep