《螺旋藻藻藍(lán)蛋白制備技術(shù)規(guī)范》

ICSXX.XXX.XX

XXX

T/QMIS

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/QMISXXX—2023

螺旋藻藻藍(lán)蛋白制備技術(shù)規(guī)范

PreparationofPhycocyaninfromSpirulina

2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實(shí)施

青島微藻產(chǎn)業(yè)學(xué)會(huì)發(fā)布

T/QMISXXX—2023

螺旋藻藻藍(lán)蛋白制備技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了螺旋藻藻藍(lán)蛋白制備過程中細(xì)胞破壁、固液分離、超濾濃縮、干燥等制備技術(shù)及

相關(guān)要求。

本文件適用于從螺旋藻中制備食品級(jí)藻藍(lán)蛋白粉劑的過程。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件，僅

該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于

本文件。

GB1886.309食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑藻藍(lán)蛋白

GB5009.3食品中水分的測定

GB5009.11食品中總砷及無機(jī)砷的測定

GB5009.12食品中鉛的測定

GB5009.17食品中總汞及有機(jī)汞的測定

GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

GB/T16919食用螺旋藻粉

GB25564食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑磷酸二氫鈉

GB25568食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑磷酸氫二鈉

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

螺旋藻藻藍(lán)蛋白（PhycocyaninfromSpirulina）：以淡水或海水養(yǎng)殖的螺旋藻（Spirulina）為原

材料，經(jīng)水抽提、純化等工藝制得的一種亮藍(lán)色蛋白。

4材料原輔料及儀器設(shè)備

4.1螺旋藻粉

應(yīng)符合GB16919的有關(guān)規(guī)定；藻泥是指經(jīng)過離心收集得到的未經(jīng)干燥、具有較高含水量的濕螺

旋藻。

4.2磷酸鹽緩沖液

應(yīng)符合GB25564和GB25568的有關(guān)規(guī)定，詳見附錄A。

4.3濾膜

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材料為醋酸纖維或硝化纖維的濾膜，其中粗略要求孔徑0.45μm，超濾要求膜截留分子量介于5

kDa~10kDa。

4.4離心機(jī)

可以使用平板式離心機(jī)、三足式離心機(jī)、臥式離心機(jī)、管式離心機(jī)和碟式離心機(jī)等，要求離心

力4000g~6000g，離心溫度不超過20℃，離心后上清液無肉眼可見的雜質(zhì)，能夠去除固體殘?jiān)?/p>

4.5分光光度計(jì)

波長范圍190nm~1100nm可調(diào)。

4.6噴霧干燥機(jī)

進(jìn)風(fēng)溫度為190±10℃，出風(fēng)溫度為80±5℃。

5制備過程

5.1制備流程

藻藍(lán)蛋白制備流程圖詳見附錄B。

5.2破壁

5.2.1原理

將螺旋藻粉或藻泥經(jīng)過凍融、酶解、溶脹、化學(xué)、機(jī)械研磨等方法或其組合，使螺旋藻細(xì)胞破

裂，將藻藍(lán)蛋白釋放至磷酸鹽緩沖液中。

5.2.2凍融法破壁

用蒸餾水制冰，再進(jìn)一步破碎至20目~40目（約425μm~800μm）制成冰粉。準(zhǔn)確稱取螺旋藻粉，

按照藻粉或藻泥與冰粉質(zhì)量比為1:10~1:20的比例加入-10℃的冰粉。將上述的螺旋藻藻粉或藻泥和

冰粉混合物置于攪拌罐內(nèi)，在800rpm~1200rpm的攪拌速度下，并保持罐體溫度在0℃以下，破壁處

理80min~120min。破壁處理結(jié)束后，等冰粉自然融化，得到含有藻藍(lán)蛋白粗提液的破壁液。

5.2.3機(jī)械破壁

準(zhǔn)確稱取螺旋藻粉或藻泥，按10%~15%（質(zhì)量體積比）比例加入4℃，0.01M的磷酸鹽緩沖液（pH

6.8）中，在混合顆粒機(jī)中充分混勻。然后用5目尼龍網(wǎng)搖擺顆粒機(jī)制成螺旋藻濕粒，再經(jīng)膠體磨循

環(huán)研磨，充分粉碎。

5.2.4壓力破壁

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加壓破碎：準(zhǔn)確稱取螺旋藻粉或藻泥，按10%~15%（質(zhì)量體積比）比例加入4℃，0.01M的磷酸

鹽緩沖液（pH6.8），充分混勻，在4℃，壓力為40MPa~70MPa條件下進(jìn)行高壓勻質(zhì)破壁2~5次，得

到螺旋藻破壁液。

減壓破碎：準(zhǔn)確稱取螺旋藻粉或藻泥，按10%~15%（質(zhì)量體積比）比例加入4℃，0.01M的磷酸

鹽緩沖液（pH6.8），充分混勻，從壓力40MPa~70MPa，穩(wěn)步減壓至0.1MPa，攪拌破壁1h，得到

螺旋藻破壁液。

5.2.5酶解破壁

準(zhǔn)確稱取螺旋藻粉或藻泥，按照藻:水為1:2~1:3（質(zhì)量比）比例用蒸餾水浸泡，可加入適量抑菌

劑，室溫下避光攪拌過夜。按照酶溶液:藻為1.0~1.5:100（質(zhì)量比）加入1.5%（質(zhì)量體積比）的纖維

素酶溶液室溫降解細(xì)胞壁5h~10h。超聲波反復(fù)提取2~3次，超聲波功率為900W，超聲每次提取時(shí)

間25min。

5.3固液分離

將破壁后的混合物離心（4000g~6000g，溫度不超過20℃），離心后上清液無肉眼可見的雜質(zhì)，

去除固體殘?jiān)?/p>

5.4粗濾

上清液分別經(jīng)孔徑為25μm濾布和0.45μm濾膜過濾，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

5.5超濾濃縮與脫鹽

將藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)超濾膜（超濾膜截留分子量介于5kDa~10kDa）過濾，以半連續(xù)或反復(fù)補(bǔ)

加清水方式，完全脫除提取物中的外源無機(jī)鹽和小于截留值的細(xì)胞內(nèi)源性可溶雜質(zhì)分子，并且折算

OD620≥300。

5.6干燥

對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥處理，進(jìn)風(fēng)溫度為190±10℃，出風(fēng)溫度為80±5℃，或?qū)饪s液進(jìn)行冷凍

干燥處理，制得藻藍(lán)蛋白粉劑。依據(jù)上述方法，制得的藻藍(lán)蛋白為寶石藍(lán)色的水溶性干粉劑，達(dá)到

藻藍(lán)蛋白國家標(biāo)準(zhǔn)（GB1886.309）的要求。

5.7鑒別試驗(yàn)

稱取0.05g試樣，精確至0.0001g，用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）定容于100mL容量瓶中，配成

待測液，溶液顯示藍(lán)色，在620nm的波長處具有最大吸收值，在610nm至630nm激發(fā)下，可以發(fā)出

紅色熒光。將待測液在90℃加熱30min左右，熒光消失。在5mL待測液中，緩慢加入3.3g細(xì)粉狀的

硫酸銨并將其溶解，逐漸產(chǎn)生藍(lán)色沉淀。

5.8藻藍(lán)蛋白質(zhì)量檢測

藻藍(lán)蛋白的感官要求和理化指標(biāo)應(yīng)符合GB1886.309的有關(guān)規(guī)定。

6保存

螺旋藻藻藍(lán)蛋白粉劑應(yīng)置于陰涼、避光處，干燥密閉保存。

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T/QMISXXX—2023

附錄A磷酸鹽緩沖液的配置

0.01M，pH6.8磷酸鹽緩沖液的配置方法：

A液（0.2M磷酸二氫鈉水溶液）：NaH2PO42H2O稱量31.20g，溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。

B液（0.2M磷酸氫二鈉水溶液）：Na2HPO47H2O稱量53.61g（或Na2HPO412H2O71.63g或Na2H

PO42H2O35.61g），溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL。

取61.0mLA液與49.0mL